转基因植物NOS 终止子核酸检测试剂盒说明书

转基因植物NOS 终止子核酸检测试剂盒(荧光-PCR 法)

【产品名称】

通用名称：转基因植物 NOS 终止子核酸检测试剂盒(荧光-PCR 法) 

Name ：tNOS Gene Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包装规格】50T/盒

【预期用途】

根农杆菌烟脂碱合成酶基因终止子（tNOS）是转基因作物常用到的元件之一，   到目前为止，43%的转基因作物含有 NOS 终止子。荧光 PCR 技术因其灵敏度高、特异性强等特点，在转基因检测中发挥了重要作用。

本试剂盒适用于检测转基因植物的 NOS 终止子基因，用于筛查待检测植物中是否含有 NOS 成分。。

【检验原理】

本试剂盒根据 NOS 终止子序列设计特异性引物和探针[1-3]，用荧光 PCR 技术进行转基因成分的检测。

【试剂组成】

注：

1）  不同批号试剂不能混用。

2）  试剂盒内各试剂组份足够包装规格所标示的检测次数。

【储存条件及有效期】

-20℃避光保存、运输、反复冻融不超过 5 次，有效期 12 个月。

【适用仪器】

ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、MJ Opticon2、LightCycler480、Bio-Rad、eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

称取 200g 样品。

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标本运送应采用 0℃冰壶。

【使用方法】

1.  样品处理（样本处理区）

1.1  样本前处理

固体样本：用粉碎机或冷冻研磨仪将样品研磨至细粉状。

1.2  DNA 提取

推荐采用优利科（上海）生命科学有限公司生产的 DNA 提取试剂盒（离心柱提取

法），请按照试剂盒说明书进行操作。

2.  试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；反应管数每满 10 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，21uL/管。

3.  加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的 DNA、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL，加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4.  PCR 扩增（核酸扩增区）

4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；

4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25ul；荧光通道选择： 检测通道

（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）选择 NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择 None 即可。

4.3 推荐循环参数设置：

5.  结果分析判定

5.1  结果分析条件设定

设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。

5.2  结果判断

阳性：检测通道 Ct 值≤35，且曲线有明显的指数增长曲线；

可疑：检测通道 35<Ct 值≤38，建议重复检测，如果检测通道仍为 35<Ct 值

≤38，且曲线有明显的增长曲线，判定为阳性，否则为阴性； 阴性：样本检测结果 Ct 值>38 或无 Ct 值。

6.  质控标准

阴性质控品：Ct>38 或无 Ct 值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

7.  检测方法的局限性

Ø 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

Ø 样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

Ø 阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

Ø 病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

Ø 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

Ø 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或   定量检测不准确的结果；

Ø 本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

【注意事项】

Ø 所有操作严格按照说明书进行；

Ø 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，wan全混匀并短暂离心；

Ø 反应液应避光保存；

Ø 反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

Ø 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

Ø 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

Ø 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

Ø 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全   通则》进行处理。.

【参考文献】

[1]  中国农业部. 1782 号公告-3-2012 转基因植物及其产品成分检测调控元件CamV 35S 启动子、FMV 35S 启动子、NOS 启动子、NOS 终止子和 CaMV 35S 终止子定性 PCR 方法[S]. 北京: 科学出版社, 2012.

[2] 徐俊锋, 王鹏飞, 李玥莹, 等. 转基因植物中CaMV35S 和tNOS 元件的 4 种定性PCR 检测方法的比较. 农业生物技术学报, 2015 , 23 (3) :397-407.

[3] 周建嫦, 杨明杰, 杨杏芬. PCR 法检测食品和动物饲料中的转基因成分[J]. 卫生研究, 2005 , 34 (6) :732-735.