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转基因植物NOS 终止子核酸检测试剂盒说明书

发布时间:2023/3/14      点击次数:735

转基因植物NOS 终止子核酸检测试剂盒(荧光-PCR 法)


【产品名称】

通用名称:转基因植物 NOS 终止子核酸检测试剂盒(荧光-PCR 法) 

Name :tNOS Gene Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包装规格】50T/盒

【预期用途】

根农杆菌烟脂碱合成酶基因终止子(tNOS)是转基因作物常用到的元件之一,   到目前为止,43%的转基因作物含有 NOS 终止子。荧光 PCR 技术因其灵敏度高、特异性强等特点,在转基因检测中发挥了重要作用。

本试剂盒适用于检测转基因植物的 NOS 终止子基因,用于筛查待检测植物中是否含有 NOS 成分。。

【检验原理】

本试剂盒根据 NOS 终止子序列设计特异性引物和探针[1-3],用荧光 PCR 技术进行转基因成分的检测。

【试剂组成】

名          称

规         格

酶液

50μL×1 管

tNOS 反应液

500μL×2 管

tNOS 阳性质控品

50μL ×1 管

阴性质控品

250μL ×1 管







注:

1)  不同批号试剂不能混用。

2)  试剂盒内各试剂组份足够包装规格所标示的检测次数。

【储存条件及有效期】

-20℃避光保存、运输、反复冻融不超过 5 次,有效期 12 个月。

【适用仪器】

ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、MJ Opticon2、LightCycler480、Bio-Rad、eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

称取 200g 样品。

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃,长期保存可置-70℃,但不能超过 6 个月,标本运送应采用 0℃冰壶。

【使用方法】

1.  样品处理(样本处理区)

1.1  样本前处理

固体样本:用粉碎机或冷冻研磨仪将样品研磨至细粉状。

1.2  DNA 提取

推荐采用优利科(上海)生命科学有限公司生产的 DNA 提取试剂盒(离心柱提取

法),请按照试剂盒说明书进行操作。

2.  试剂配制(试剂准备区)

根据待检测样本总数,设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照;反应管数每满 10 份,多配制 1 份),每测试反应体系配制如下表:

试剂

tNOS   反应液

酶液

用量

20μL

1μL

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中,21uL/管。

3.  加样(样本处理区)

将步骤 1 提取的 DNA、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL,加入相应的反应管中,盖好管盖,混匀,短暂离心。

4.  PCR 扩增(核酸扩增区)

4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内;

4.2 设置好通道、样品信息,反应体系设置为 25ul;荧光通道选择: 检测通道

(Reporter Dye)FAM, 淬灭通道(Quencher Dye)选择 NONE,ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光,选择 None 即可。

4.3 推荐循环参数设置:


步骤

循环数

温度

时间

收集荧光信号

1

1 cycle

95℃

10min

2

40 cycles

94℃

15sec

55℃

30sec






5.  结果分析判定

5.1  结果分析条件设定

设置 Baseline 和 Threshold:一般直接按机器自动分析的结果分析,当曲线出现整体倾斜时,根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节),以及Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照),重新分析结果。

5.2  结果判断

阳性:检测通道 Ct 值≤35,且曲线有明显的指数增长曲线;

可疑:检测通道 35<Ct 值≤38,建议重复检测,如果检测通道仍为 35<Ct 值

≤38,且曲线有明显的增长曲线,判定为阳性,否则为阴性; 阴性:样本检测结果 Ct 值>38 或无 Ct 值。

6.  质控标准

阴性质控品:Ct>38 或无 Ct 值显示;

阳性质控品:扩增曲线有明显指数生长期,且 Ct 值≤32; 以上条件应同时满足,否则实验视为无效。

7.  检测方法的局限性

Ø 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关;

Ø 样本提取过程中没有控制好交叉污染,会出现假阳性结果;

Ø 阳性对照、扩增产物泄漏,会导致假阳性结果;

Ø 病原体在流行过程中基因突变、重组,会导致假阴性结果;

Ø 不同的提取方法存在提取效率差异,会导致假阴性结果;

Ø 试剂运输,保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降,出现假阴性或   定量检测不准确的结果;

Ø 本检测结果仅供参考,如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

 

【注意事项】

Ø 所有操作严格按照说明书进行;

Ø 试剂盒内各种组分使用前应自然融化,wan全混匀并短暂离心;

Ø 反应液应避光保存;

Ø 反应中尽量避免气泡存在,管盖需盖紧;

Ø 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服;

Ø 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行,以免交叉污染;

Ø 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器;

Ø 试剂盒里所有物品应视为污染物对待,并按照《微生物生物医学实验室生物安全   通则》进行处理。.

【参考文献】

[1]  中国农业部. 1782 号公告-3-2012 转基因植物及其产品成分检测调控元件CamV 35S 启动子、FMV 35S 启动子、NOS 启动子、NOS 终止子和 CaMV 35S 终止子定性 PCR 方法[S]. 北京: 科学出版社, 2012.

[2] 徐俊锋, 王鹏飞, 李玥莹, 等. 转基因植物中CaMV35S 和tNOS 元件的 4 种定性PCR 检测方法的比较. 农业生物技术学报, 2015 , 23 (3) :397-407.

[3] 周建嫦, 杨明杰, 杨杏芬. PCR 法检测食品和动物饲料中的转基因成分[J]. 卫生研究, 2005 , 34 (6) :732-735.


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