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NAD-苹果酸酶(NAD-ME)试剂盒

简要描述:NAD-苹果酸酶(NAD-ME)试剂盒测定意义:ME广泛存在于微生物、培养细胞、动物和植物胞浆中,尤其在植物组织中活性较高。ME催化苹果酸氧化脱羧的可逆反应,产生丙酮酸和CO2,以及伴随NAD(P)+的还原反应,是苹果酸代谢的关键酶。ME活性与生物合成和抗氧化密切相关。

  • 更新时间:2023-07-09
  • 厂商性质:生产厂家
  • 生产地址:上海
  • 访  问  量:467

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详细介绍

品牌YLKBIOCAS详见说明书
分子式详见说明书纯度详见说明书
分子量详见说明书货号YLK-SH122
规格100管/96样、50管/48样供货周期现货
主要用途科研应用领域化工,生物产业
测定方法:微量法、紫外分光光度法

NAD-苹果酸酶(NAD-ME试剂盒说明书

                                        微量法100/96

 

    意:正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

ME广泛存在于微生物、培养细胞、动物和植物胞浆中,尤其在植物组织中活性较高。ME催化苹果酸氧化脱羧的可逆反应,产生丙酮酸和CO2,以及伴随NAD(P)+的还原反应,是苹果酸代谢的关键酶。ME活性与生物合成和抗氧化密切相关。近年来植物ME活性测定较多,已经成为抗氧化研究的热点。根据辅酶专一性和对底物特异性的不同,可将ME分为NAD-ME(EC1.1.1.38)NADP-ME(EC1.1.1.40)

 

测定原理:

NAD-ME催化NAD+还原成NADH,在340nm下测定NADH增加速率。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸馏水。

 

试剂的组成和配制:

提取液:100mL×1瓶,4保存。;

试剂一:液体20mL×1瓶,4℃保存;

试剂二:液体10mL×1瓶,4℃保存;

试剂三:粉剂×1瓶,-20℃保存;

 

样本的前处理:

1、细菌、细胞或组织样品的制备:

细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~10001的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4离心10min,取上清,置冰上待测。

组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4离心10min,取上清,置冰上待测。

2、血清(浆)样品:直接检测。

 

测定步骤:

1、  分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。

2、   检测工作液的配制:用时在试剂三中加入15mL试剂一和1mL蒸馏水,充分混匀待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

3、   测定前将检测工作液在37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴10min以上。

4、在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、55μL试剂二和160μL工作液,混匀后立即记录340nm处初始吸光值A1 1min后的吸光值A2计算ΔA=A2-A1

注意:如果ΔA0.005,可将反应时间延长到2分钟或5分钟。

 

 

NAD-ME活性计算:

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

NAD-MEnmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T= 3617×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织每分钟生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

NAD-MEnmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(W× V÷V样总) ÷T = 3617×ΔA÷W

3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

NAD-MEnmol/min/104 cell=[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(500×V÷V样总) ÷T =7.234×ΔA

V反总:反应体系总体积,2.25×10-4 LεNADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cmd:比色皿光径,1cmV样:加入样本体积,0.01 mLV样总:加入提取液体积,1 mLT:反应时间,1 minCpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本质量,g500:细菌或细胞总数,500万。

 

b . 96孔板测定的计算公式如下

1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

NAD-MEnmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(Cpr×V) ÷T= 7234×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织每分钟生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

NAD-MEnmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(V÷V样总×W) ÷T = 7234×ΔA÷W

3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

NAD-MEnmol/min/104 cell=[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(V÷V样总×500) ÷T =14.468×ΔA

V反总:反应体系总体积,2.25×10-4 LεNADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mold96孔板光径,0.5cmV样:加入样本体积,0.01 mLV样总:加入提取液体积,1 mLT:反应时间,1 minCpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本质量;500:细菌或细胞总数,500万。

NAD-苹果酸酶(NAD-ME试剂盒仅供科研!

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