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猪蓝耳病毒经典型/猪蓝耳病毒NADC30株核酸检测试剂盒双重荧光PCR

发布时间:2022-04-21      点击次数:374

【产品名称】

商品名: 猪蓝耳病毒经典型/猪蓝耳病毒 NADC30 株(PRRSV-C/PRRSV-NADC30)核酸检测试剂盒(双重荧PCR 法)

Name Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome classical type and NADC30 type Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包装规格】50T/

【预期用途】 猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome, PRRS),又称蓝耳病,是由猪繁殖 与呼吸综合征病毒引起猪的高度接触性传染病,是影响世界养猪业健康发展的重要传染病之一。 本试剂盒适用于检测猪扁桃体、脑组织、血液等标本中的猪蓝耳病毒经典型和猪蓝耳病毒 NADC30 株, 适用于这 2 种病原感染的辅助诊断及流行病学调查。

【检验原理】 本试剂盒分别根据猪蓝耳病毒经典型和猪蓝耳病毒 NADC30 株基因保守区设计特异性引物和探针,用一 步法荧光 RT-PCR 技术对这 2 种病毒 RNA 进行体外扩增检测,用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

【试剂组成】

 

 

 
包装规格 50T/
PRRSV-C/-NADC30反应液 500μL×2
酶液 50μL×1
PRRSV-C/-NADC30 阳性质控品 50μL ×1
阴性质控品 250μL ×1

说明:不同批号的试剂盒组分不可交互使用。

【储存条件及有效期】 -20℃±5℃,避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次,有效期 9 个月。

【适用仪器】 ABI 系列 、安捷伦 MX3000P/3005PBio-Rad CFX96 等荧光定量 PCR 仪。

【标本采集】 病死或扑杀猪,取扁桃体和脑组织;待检活猪,用注射器取血 5mL EDTA-2Na 抗凝管。

【保存和运输】 上述标本短期内可保存于-20℃,长期保存可置-70℃,但不能超过 6 个月,标本运送应采用 2~8℃冰袋运 输,严禁反复冻融。

【使用方法】 1. 样品处理(样本处理区)

1.1 样本前处理 取组织样品约 1g 于研磨器中研磨,加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨,待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中, 8000rpm 离心 2min,取上清液 100μL 1.5mL 灭菌离心管中;血液样品取血清 100μL 提取。

1.2 核酸提取 推荐采用优利科(上海)生命科学有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(磁珠法或离心柱法)进行核酸提取,请按 照试剂说明书进行操作。

2. 试剂配制(试剂准备区) 根据待检测样本总数,设所需要的 PCR 反应管管数为 NN=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照;反应 管数每满 10 份,多配制 1 份),每测试反应体系配制如下表:

 

试剂 PRRSV-C/-NADC30 反应液 酶液
20μL 1μL

 

 

 

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中,21μL/管。

3. 加样(样本处理区) 将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL,分别加入相应的反应管中,盖好管盖,混匀, 短暂离心。

4. PCR 扩增(核酸扩增区)

4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内;

4.2 设置好通道、样品信息,反应体系设置为 25μL;荧光通道选择:检测通道(Reporter DyeFAMCY5淬灭通道(Quencher Dye)选择 NONEABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光。

4.3 推荐循环参数设置:

 

 

步骤 循环数 温度 时间 收集荧光信号
1 1cycle 42 20min
2 1 cycle 95℃ 10min
3 40 cycle 94℃ 15sec
    55℃ 30sec

 

 

 

 

 

 

 

5. 结果分析判定

5.1 结果分析条件设定 设置 Baseline Threshold:一般直接按机器自动分析的结果分析,当曲线出现整体倾斜时,根据分析后图 像调节 Baseline start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节),以及 Threshold Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照),重新分析结果。

5.2 结果判断 FAM 通道为猪蓝耳病毒经典型检测结果,CY5 通道为猪蓝耳病毒 NADC30 株检测结果 阳性:检测通道 Ct ≤35,且曲线有明显的指数增长曲线; 可疑:检测通道 35<Ct ≤38,建议重复检测,如果检测通道仍为 35<Ct ≤38,且曲线有明显的增长曲线, 判定为阳性,否则为阴性; 阴性:样本检测结果 Ct >38 或无 Ct 值。

6. 质控标准 阴性质控品:Ct >38 或无 Ct 值; 阳性质控品:扩增曲线有明显指数生长期,且 Ct ≤32;以上条件应同时满足,否则实验视为无效。

7. 检测方法的局限性 1.样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关;

2.样本提取过程中没有控制好交叉污染,会出现假阳性结果;

3.阳性对照、扩增产物泄漏,会导致假阳性结果;

4.病原体在流行过程中基因突变、重组,会导致假阴性结果;

5.不同的提取方法存在提取效率差异,会导致假阴性结果;

6.试剂运输,保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降,出现假阴性或定量检测不准确的结果;

7.本检测结果仅供参考,如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

【注意事项】

1.所有操作严格按照说明书进行;

2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化,完全混匀并短暂离心; 

3.反应液应避光保存;

4.反应中尽量避免气泡存在,管盖需盖紧;

5.使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服;

6.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行,以免交叉污染;

7.实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器;

8.试剂盒里所有物品应视为污染物对待,并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

 

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