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酶联免疫吸附测定试剂盒样本处理方法

发布时间:2022-04-23      点击次数:255

A、血液样本

    有些生理因素,如吸烟、进食、运动、情绪波动、妊娠、体位等均可影响血液中某些成分的变化,有些甚至还有昼夜变化。因此血液标本的采集应尽量避免生理因素干扰,以条件一致为宜,如无法避免,应在标本上注明该因素。


1.外周血

    一般选取左手无名指内侧采血,该部位应无冻疮,炎症,水肿,破损。如该部位不符合要求,以其他手指部位代替。对烧伤病人,可选择皮肤完整处采血。由于部分血液常规检测(如白细胞计数、分类等)受生理因素影响波动过大,比较时宜使条件尽量一致。涉及到体内出、凝血功能的检测项目(如血小板计数,出血时间或凝血时间等)的检测,一定要注意了解患者是否用过抗凝、促凝药物,以便在减少或避免干扰因素的影响。

2.静脉血

    除涉及各种止血和血栓检测等项目需采用抗凝静脉血血浆外,目前绝大多数检测项目的分析检测可直接采用静脉血的血清。在血清检测项目中,有些(如血糖,血脂等)受饮食及昼夜因素影响较大,一般以清晨空腹血标本为宜;有些在血中衰变较快(血清酶活性测定如ACP活性等),0~4℃贮存活性减弱也不一,这些项目的检测必须及时而快速;有些(如肌酸激酶等)受运动等因素影响较大。抽血时避免溶血的发生也十分重要,尤其涉及血钾,LDH等的测定。

 

B、尿液样本

同血标本一样,尿液标本受饮食、运动、药物量等因素的影响也较大,特别是饮食的影响,故一般来说晨尿优于随机尿。晨尿是指清晨起床后的第一次尿标本,较浓缩和酸化,有形成分(如血细胞,上皮细胞,管形)相对集中便于观察。随机尿即随意一次尿,留取方便,但受饮食、运动、药物影响较甚,易于出现假阳性和假阴性结果,如饮食性蛋白尿,饮食性糖尿,维生-素C干扰潜血结果等。餐后尿(午餐后2小时收集的患者尿液)适用于尿糖,尿蛋白和尿胆原的检查,此时的尿标本可增加试验敏感性,检出较轻微的病变。12小时尿细胞计数即Addis计数(前晚8时排空膀胱后留取至次日晨8时的所有尿液),因时间较长,细菌易繁殖,须加入防腐剂甲醛。24小时尿(第一天晨8时排空膀胱后留取至次日晨8时的所有尿液)中化学物质的定量,包括蛋白,糖,尿17-酮、17-羟类固醇,儿茶酚胺,Ca2+等,检测不同的物质,选择不同的防腐剂防腐。清洁中段尿多用于尿细菌培养,要求无菌,冲洗外阴后留取标本。所有尿标本的收集都应足量,最少12 ml,最好50 ml,定时尿须全部收集,对女性患者应避免阴道分泌物、经血污染尿标本。

用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。

 

C、粪便样本

    粪便标本的检测对判断消化系统疾病有重要参考价值。采集时要求用干净的竹签选取含有粘液、脓血等异常病变成分的粪便,对外观无异常的粪便须从表面、深处及粪端多处取材。找寄生虫虫体及作虫卵计数应收集24小时粪便。查痢疾阿米巴滋养体应于排便后立即检查,从有脓血和稀软处取材,保温送检。查日本血吸虫虫卵时应取粘液、脓血部分,孵化毛蚴时至少留取30g粪便,且需尽快处理。检查蛲虫卵须用透明薄膜拭子于晚12时或清晨排便前自肛-门周围皱襞处拭取并立即镜检。隐血试验(化学法),试验前3日禁食肉类及含动物血食物并禁服铁剂,维生-素C等。所有粪便标本采集后1小时内应检查完毕,以防止有形成分受消化酶及pH的破坏,来不及检测的,应及时用PBS进行缓冲处理,离心去上清保存。

尽量采集干的粪便,粪便过稀会较难处理且降低检测的准确性。采集的重量应大于 50 mg,将粪便用 PBS 洗 3 次(最终粪便质量:PBS 体积=1:9),用超声粉碎(或捣碎)后于 5000×g 离心 10 分钟,取上清检测。


D、脑脊液样本

脑脊液标本采集后立即送检,放置过久将影响检验结果:如细胞变性,破坏,导致计数和分类不准;有些化学物质如葡萄糖等将分解含量减少;细菌发生自溶影响细菌的检出率。脑脊液抽取后一般分装三个无菌管,第一管作细菌培养,第二管作化学分析和免疫学检查,第三管作一般性状及显微镜检查,三管的顺序不宜颠倒。因标本采集较难,全部送检和检测过程应注意安全。


E、胸腹水样本

与脑脊液标本一样,采集后的标本注意安全,及时送检。一般也分装三管,一管作常规细胞学检查,一管生化检查,一管细菌培养,顺序以与脑脊液相同为宜。


F、前列腺液样本

    前列腺液标本由前列腺按摩后采集,液量少时直接滴在载玻片上及时送检,须注意防止标本蒸干,量多时收集在洁净干燥的试管中。若按摩不出前列腺液,可检查按摩后的尿液沉渣。

 

G、精液样本

精液标本采集前应禁欲3~7天,排净尿液后可用手淫法或其他方法将精液直接排入干净的容器中,保温并及时送检。由于精-子生成日间变动较大,一般应检查2~3次(每次间隔1~2周)方可做诊断。

将精液收集于无菌容器中,正常精液射出体外呈稠厚的胶冻状,射出体外后需在室温或 37 度水浴箱中使其在前列腺分泌的纤维蛋白溶解酶的作用下液化,变的稀薄。待精液*液化后,将精液 4000 rpm 离心 10 分钟分离精浆进行检测。

 

H、阴道分泌物样本

    阴道标本采集前24小时应禁止房事、盆浴、阴道检查、阴道灌洗及局部上药等,取材所用器械需清洁。一般用盐水浸湿的棉拭子自阴道深部或阴道穹后部、宫颈管口等处取材,制成生理盐水涂片后观察阴道分泌物标本,经期的女性患者不宜检查阴道分泌物标本。


(二) ELISA的样本实验准备

在收集样本前都必须有一个完整的计划,必须清楚要检测的成份是否足够稳定。对收集后当天就进行

检测的样本,及时储存在4℃备用。对于隔天再检测的样本,及时分装后冻存在-20℃备用,有条件的,最好-70℃冻存备用。标本应避免反复冻融。


    液体类标本:  包括血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、细胞培养上清等。

1. 血清:

室温血液自然凝固10-20分钟后,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。

2. 血浆:

应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂,混合10-20分钟后,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。

3. 尿液:

用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。胸腹水、脑脊液参照此实行。

4. 细胞培养上清:

检测分泌性的成份时,用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。

5. 培养细胞

    检测细胞内的成份时,用PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液,细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融或加入组织蛋白萃取试剂,以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。

6. 组织标本

切割标本后,称取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS(PH7.4),或组织蛋白萃取试剂, 用手工或匀浆器将标本匀浆化。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。分装后一份待检

测,其余冷冻备用。

7. 牛奶

方法1

取牛奶10ml入离心管,加入10ml乙酸乙酯,超声震荡30min。

然后4000g离心10min(如两相之间出现乳化层,则将样品瓶放在80℃的水浴中约5min,再离心)移取1ml乙酸乙酯层至另外试管中,60℃氮气流下蒸干,残留物用缓冲液2ml缓冲后备用,前处理过程约需2小时。

方法2

取10ml牛奶10℃3500G离心10MIN,祛除上层脂肪,取5ml脱脂奶粉加入150微升17.2%亚铁氰-化钾,出现沉淀,漩涡混合,然后加入150微升53.5%硫酸锌。再次漩涡混合。15摄氏度3500g离心10分钟,取上层清液用缓冲液1:2稀释待用,前处理过程所需1小时。

处理样本的过程就是收集目标蛋白的过程,由于蛋白容易变性,降解,故该过程应尽量温和。样本处理之后的储存也非常重要,尤其注意不要反复冻融,样本处理之后可分装密封保存,4 度保存应小于 1 周,-20 度不应超过 1 个月,-80 度不应超过 2 个月。在标本使用前应缓慢均衡至室温,不应加热使之融解。样本的处理是实验成功的第一步


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