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细胞复苏、传代与冻存操作流程

更新时间:2023-03-02      点击次数:703

细胞复苏、传代与冻存操作流程

仪器与试剂

仪器

试剂

耗材

离心机

胎牛血清(FBS

离心管(15ml50ml

生物安全柜

无菌 1×PBS pH=7.2

T-25 细胞培养瓶

电动移液器

0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA

一次性无菌移液管(2ml5ml10ml

CO2 培养箱

wan培养基(含血清)

1.8mL 冻存管

倒置显微镜



液氮罐


冻存液:90%FBS+10%DMSO



异丙醇


程序降温盒

恒温水浴锅



超低温冰箱



护目镜、厚毛线手套等

操作流程

复苏

1)将恒温水浴锅中的水预热到 37℃

2

)准备一支 15ml 离心管,加入 5ml 10%FBS wan全培养基,放入 37℃水浴锅中预热;

3

)戴上护目镜,厚毛线手套后,从液氮罐中取出要复苏的细胞,尽快转入 37℃恒温水浴锅中复温晃动冻存管以提高复温速率;

4

)将融化了的冻存管中的细胞吸入事先准中,混匀后,1000rpm 离心 5min

5

)准备一个 T-25 培养瓶,写上细胞名称、日期,再加入 4ml wan全备的离心管培养基;

6

)离心完成后弃去上清,用 1ml wan全培养基重悬细胞后,转入 T-25 细胞培养中,混匀后转入O2 培养箱中培养静置。



注意:从液氮中取出细胞冻存管时,若冻存管内有液氮进入,需拧松冻存管,排出内部残留的液氮,之后拧紧冻存管,置于干冰上,然后放入 37℃水浴中,避免温差太大造成液氮快速气化而爆炸。

传代

(细胞传代建议一传二)

1.

当细胞汇合度达到 85%以上时,可进行传代。

2.

在生物安全柜内,打开培养瓶瓶口,收集瓶内的培养基;

3.

向培养瓶内加入 3ml 无菌的 1×PBS  后,水平放置培养瓶,使 PBS 能够浸润到培养瓶底面上所有的面积,吸弃 PBS

4.

向瓶内加入消化液 1ml,浸润底面后放入 37℃ CO2 培养箱中孵育 1~2min

5.

孵育完成后在倒置显微镜下观察细胞是否变圆飘起,若全部消化下来则直接向培养瓶内加入2ml 10%FBS 的wan全培养基中,将悬液吸入 15ml 离心管;
注:如还有部分细胞未消化下来,可采用分步消化:
准备一个无菌的 15ml 离心管,加入 2ml 10%FBS wan全培养基;
将消化下来的细胞吸入中的离心管内中和(避免吹打);
向之前消化的培养瓶中加入 1ml 胰酶继续消化 2min 左右,轻拍培养瓶,95%左右细胞脱落后加入 2ml 10%FBS 的wan全培养基中和,中和后的细胞悬液移入中的离心管内。
6.1000rpm 离心 5min

7.

准备两个新的 T-25 培养瓶,各加入 4ml wan全培养基。

8.

离心完成后,弃上清,用 2mlwan全培养基重悬离心细胞,将重悬后的细胞转入 2 T-25 培养瓶,每个培养瓶各 1ml

9.

水平放置培养瓶,震荡混匀后,将培养瓶置于 37℃5%CO2 培养箱中静置培养。



冻存

(细胞冻存建议每瓶 T25 冻一支)

1~6

)参照传代步骤


7)离心完成后,弃上清,用 1mL 冻存液重悬细胞沉淀,然后转入 1.8ml 冻存管中;

8)将冻存管转入填充满异丙醇的程序降温盒中,之后转入-80℃冰箱中过夜降温;

9)第二天,取出降温完成的序降温盒中的冻存管,尽快转入液氮罐中保存。


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