荧光PCR法检测试剂盒是一种基于聚合酶链式反应（PCR）技术的分子生物学检测工具，其核心在于利用序列特异性的荧光标记探针来实现对靶标核酸的高特异性扩增与实时检测。该试剂盒通常包含热启动DNA聚合酶、引物、荧光探针、dNTPs及优化缓冲液等组分。
使用荧光PCR检测试剂盒，核心在于严格分区操作、精准配制反应体系并规范上机扩增。以下是关键步骤和注意事项：
1.实验前准备
分区操作：实验室应分为试剂准备区、样本制备区、扩增区和产物分析区。使用实时荧光PCR仪时，扩增区与产物分析区可合并。
试剂解冻：从-20℃冰箱取出试剂盒，室温解冻约15分钟。振荡混匀5秒，离心5秒使管壁液体集中。
2.样本处理与核酸提取
样本处理：将病毒采样管在旋涡混合仪上震荡5秒混匀。推荐使用磁珠法提取核酸，加入200μL样本至提取板，20-30分钟后获得50-100μL核酸。
核酸保存：提取后若不立即检测，可暂存于-20℃或-70℃，避免反复冻融。
3.反应体系配制
分装体系：准备标记好的A、B、C管，按比例配制反应液。振荡混匀10秒，瞬时离心5秒。
加样：使用八联管分装，每孔20μL。取5μL核酸分别加入A、B、C体系，并加入阴阳性对照。盖紧管盖后瞬时离心，检查液面高度是否均一。
4.上机扩增
仪器设置：打开仪器软件。将配制好的试剂和对照品传递至扩增区。
扩增程序：通常包括逆转录（如45℃ 10分钟）、预变性（如95℃ 5分钟）和循环扩增（如95℃ 15秒，60℃ 60秒，40个循环）。
5.结果分析
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更新时间：2025-12-11
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