生长因子ELISA试剂盒是一类基于酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA）技术开发的高灵敏度、高特异性检测试剂盒，主要用于定量检测生物样本（如血清、血浆、细胞培养上清、组织匀浆等）中各类生长因子的浓度。常见的检测目标包括表皮生长因子（EGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、转化生长因子-β（TGF-β）、多效生长因子（PTN）等。
这类试剂盒通常采用“双抗体夹心法”原理：首先将针对特定生长因子的捕获抗体预包被在96孔微孔板上；加入待测样本后，目标生长因子与固相抗体结合；随后加入生物素标记的检测抗体，形成“抗体-抗原-检测抗体”复合物；再通过辣根过氧化物酶（HRP）标记的亲和素与生物素结合，最后加入显色底物（如TMB），在酶催化下产生颜色反应。颜色深浅与样本中生长因子浓度成正比，可通过酶标仪测定吸光度并计算出精确浓度。
1、实验前准备
试剂平衡：提前30分钟从4℃取出试剂盒，让所有试剂（微孔板、标准品、酶结合物、底物等）恢复至室温（18-25℃），使用前轻轻混匀，避免起泡。
洗涤液配制：若洗涤液是浓缩型（如20×或30×），需按说明用蒸馏水或去离子水稀释，若有结晶析出可温水浴助溶。
标准品稀释：取标准品原液，按说明书进行倍比稀释（如1:2或1:3），配制成至少5个浓度梯度加一个零浓度（稀释液），现用现配，不可保存。
样本处理：血清/血浆需无溶血、无高脂，离心分离后-20℃或-80℃分装保存，避免反复冻融；细胞上清需离心去除碎片。注意：样本不能含NaN₃（叠氮钠），它会抑制HRP酶活性。
2、加样与孵育（核心步骤）
加样：在酶标板孔中加入50μL或100μL的标准品、待测样本（建议做复孔）。空白孔仅加稀释液或不加样。
加酶结合物：除空白孔外，每孔加入对应体积的酶标记检测抗体（HRP标记），用封板膜封板。
第一次孵育：37℃恒温箱孵育30-60分钟（部分试剂盒为90分钟，以说明为准），此步需在湿盒或密封环境下进行，防止蒸发。
洗板：弃去液体，每孔加满洗涤液，静置30-60秒后弃去，在吸水纸上拍干，重复3-5次。洗板充分与否直接决定背景高低。
3、显色与终止
加底物：每孔加入TMB底物溶液（A液+B液或预混液）100μL左右，37℃避光显色10-20分钟。显色时间可根据标准品蓝色梯度灵活调整，但不宜过长。
终止反应：每孔加入50μL终止液（通常为稀硫酸），此时颜色由蓝变黄。若孔中心呈绿色，说明混匀不充分。
读数：终止后5-15分钟内，用酶标仪在450nm波长（参考波长630nm或570nm）测定各孔OD值。
4、计算与关键注意事项
计算：以标准品浓度为横坐标、OD值为纵坐标绘制标准曲线（常用四参数对数曲线或线性回归），代入样本OD值算出浓度，再乘以样本稀释倍数即得实际浓度。
注意事项：
加样时枪头勿蹭孔壁，每加一种样本/标准品务必更换枪头，防止交叉污染。
底物TMB若已变蓝则失效，不可使用；终止液有腐蚀性，避免直接接触。
未用完的微孔板条需放回自封袋密封，4℃保存，避免受潮。
若样本OD值超出标准曲线最高值，需用稀释液适当稀释后重测。
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更新时间：2026-05-20
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