小鼠碱性磷酸酶（AKP）ELISA试剂盒的详细操作步骤

本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠碱性磷酸酶（AKP）水平。用纯化的小鼠碱性磷酸酶（AKP）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入碱性磷酸酶（AKP），再与HRP标记的碱性磷酸酶（AKP）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的碱性磷酸酶（AKP）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠碱性磷酸酶（AKP）活性浓度。

操作步骤：

试剂准备‌：

所有试剂盒组分提前从冰箱取出，平衡至室温（18-25℃）至少30分钟；将30×浓缩洗涤液用蒸馏水按1：30比例稀释，配制成1×工作洗涤液。

标准品复溶与梯度稀释：向160ng/L的AKP冻干粉标准品中加入1.5mL标准品稀释液，静置10分钟待溶解后，通过倍比稀释依次配制出80ng/L、40ng/L、20ng/L、10ng/L、5ng/L的梯度标准工作液。

加样温育‌：

提前设置空白孔、标准品孔、待测样本孔：空白孔不加任何液体，标准品孔每孔加入50μL不同浓度的梯度标准液，待测样本孔中先加40μL样品稀释液，再加入10μL预处理好的样本上清（样本最终稀释度为5倍）。

轻轻晃动酶标板混匀，贴上封板膜，置于37℃恒温培养箱中温育‌30分钟。

洗板与酶促结合‌：

小心揭掉封板膜，弃去孔中液体，在吸水纸上拍干；每孔加满1×洗涤液，静置30秒后弃去，重复洗板‌5次‌，最后一次拍干孔内残留液体。

每孔加入酶标试剂50μL（空白孔除外），重新贴好封板膜，37℃温育‌30分钟‌。

再次重复上述洗板操作5次，拍干孔内液体。

色与终止读数‌：

每孔依次加入显色剂A液、B液各50μL，轻轻晃动混匀，37℃避光显色‌10分钟‌，此时可见标准品孔从高浓度到低浓度呈现明显的蓝色梯度。

每孔加入终止液50μL，轻轻晃动混匀，此时蓝色转变为黄色。

用酶标仪在‌450nm波长‌下，15分钟内依次测定各孔的吸光度（OD值）。