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天冬酰胺合成酶(AS) 活性测定试剂盒说明书

发布时间:2023/4/9      点击次数:150

天冬酰胺合成酶(asparagine synthetaseAS) 活性测定试剂盒说明书

                                      微量法100/96

   意:正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

天冬酰胺合成酶是广泛存在于生物体内的一类氨基转移酶,催化谷氨酞胺的氨基向天冬氨酸转移。当植物处于氨毒时天冬酞胺的形成是一种解毒反应。

测定原理:

AS催化L-天冬酰胺水解成L-天冬氨酸和氨,利用奈氏试剂检测氨增加的速率,即可计算其酶活性。

需自备仪器和用品:

台式离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵、冰和双蒸水。

试剂组成和配制:

试剂一×2瓶,60 mL4 ℃保存;

试剂二×1瓶,40 mL4 ℃保存;

试剂三×1瓶,60 mL,常温保存;

试剂四×1瓶,5 mL,常温保存;

试剂五×1瓶,3 mL,常温保存;

试剂六×1瓶,3 mL,常温避光保存。

粗酶液提取:

1、细菌、细胞或组织样品的制备:

细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~10001的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL试剂一),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4离心10min,取上清,置冰上待测。

组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)15~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一),进行冰浴匀浆。8000g 4离心10min,取上清,置冰上待测。

2、血清(浆)样品:直接检测。

测定步骤:

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至420nm,蒸馏水调零。

2、样品测定(在EP管中加入下列试剂):

试剂名称(uL

测定管

对照管

样本

25


蒸馏水


25

试剂一

100

100

试剂二

400

400

混匀,37℃水浴1 小时

试剂三

525

525

混匀,8000 g25℃离心10 min;取上清液,在EP管或96孔板中加入下列试剂

上清液

130

130

试剂四

30

30

试剂五

20

20

试剂六

20

20

混匀,室温静置15min420nm处读取测定管和对照管吸光值,计算ΔA=A测定管-A对照管。对照管只要做一管。

注意:试剂六如出现沉淀,静置后取上清使用。

酶活性计算:

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准条件下测定的回归方程为y = 0.662x -0.0434x为标准品浓度(μg/mL),y吸光值A

1、血清(浆)AS活性

单位定义:每mL血清(浆)每小时产生1μg 定义为一个酶活力单位。

ASμg/h/mL)=(ΔA+0.0434) ÷0.662×V反总÷V÷T=31.722×(ΔA+0.0434)

2、组织、细菌或细胞中AS活力的计算:

1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白每小时产生1μg 定义为一个酶活力单位。

AS活力(μg/h/mg prot)=(ΔA+0.0434) ÷0.662×V反总÷(V×Cpr)÷T =31.722×(ΔA+0.0434) ÷Cpr

2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织每小时产生1μg定义为一个酶活力单位。

AS活力(μg/h/g 鲜重)=(ΔA+0.0434) ÷0.662×V反总÷(W× V÷V样总T =31.722×(ΔA +0.0434) ÷W

3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞每小时产生1μg 定义为一个酶活力单位。

AS活力(μg/h/104 cell)=(ΔA+0.0434) ÷0.662×V反总÷(500×V÷V样总) ÷T=0.0634×(ΔA+0.0434)

T:反应时间,1h V反总:反应体系总体积:0.525mLV样:加入反应体系中样本体积,0.025mLV样总:提取液体积,1mLCpr:样本蛋白质浓度,mg/mL W:样本质量, g500:细菌或细胞总数,500

b.96孔板测定的计算公式如下

标准条件下测定的回归方程为y = 0.3046x -0.0097x为标准品浓度(μg/mL),y吸光值A

1、血清(浆)AS活力的计算:

单位的定义:每mL血清(浆)每小时产生1μg 定义为一个酶活力单位。

AS活力(μg/h/mL)=(ΔA +0.0097) ÷0.3046×V反总÷V÷T=68.94×(ΔA +0.0097)

2、组织、细菌或细胞中AS活力的计算:

1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白每小时产生1μg 定义为一个酶活力单位。

AS活力(μg/h/mg prot)=(ΔA +0.0097) ÷0.3046×V反总÷(V×Cpr)÷T =68.94×(ΔA +0.0097) ÷Cpr

2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织每小时产生1μg定义为一个酶活力单位。

AS活力(μg/h/g 鲜重)=(ΔA +0.0097) ÷0.3046×V反总÷(W× V÷V样总T =68.94×(ΔA +0.0097÷W

3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞每小时产生1μg 定义为一个酶活力单位。

AS活力(μg/h/104 cell)=(ΔA+0.0097) ÷0.3046×V反总÷(500×V÷V样总) ÷T=0.1379×(ΔA +0.0097)

T:反应时间,1h V反总:反应体系总体积:0.525mLV样:加入反应体系中样本体积,0.025mLV样总:提取液体积,1mLCpr:样本蛋白质浓度,mg/mL W:样本质量, g500:细菌或细胞总数,500万。



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