4-香豆酸：辅酶 A 连接酶（ 4-coumarate:CoA ligase，4CL)

试剂盒说明书

微量法 100 管/48 样

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

4CL 是连接苯丙酸途径与木质素特异合成途径的关键酶，主要催化肉桂酸生成相应的肉桂酸辅酶 A 酯，是合成木质素与其他苯丙烷类化合物的代谢流向调控点。该酶主要存在于高等植物、酵母和菌类中，研究该酶可以探讨多种生物细胞发育过程中木质素沉积的代谢机理， 为减少水果石细胞含量而提高其品质提供依据。

测定原理：

4CL 催化 4-香豆酸和 CoA 生成 4-香豆酸 CoA，在 333nm 下测 4-香豆酸 CoA 生成速率，即可反映 4CL 活性。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板（UV 板）、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：100mL×1  瓶，4℃保存；

试剂一：液体 25 mL×1 瓶， 4℃保存； 试剂二：粉剂×2 瓶，-20℃保存；

粗酶液提取：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量

（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、 分光光度计或酶标仪 40℃预热 30min 以上，调节波长至 333nm，蒸馏水调零。

2、 准备 96 孔 UV 板一块（非普通酶标板，普通酶标板只能透过可见光，不能透过紫外光， 检测波长小于 340nm 务必使用 UV 板）。

3、 样本测定

（1）   在试剂二中加入 5mL 试剂一充分溶解混匀，置于 40℃水浴预热 10min；现配现用（ 配好后 24h 内用完）；

（2）   对照管：在微量石英比色皿或 96 孔 UV 板中加入 10μL 样本和 190μL 试剂一，混匀，立即记录 333nm 处 40℃反应 30min 后的吸光值A1。

（3）   测定管：在微量石英比色皿或 96 孔 UV 板中加入 10μL 样本和 190μL 试剂二，混匀，立即记录 333nm 处 40℃反应 30min 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A2-A1。每个测定管设一个对照管。

4CL 活性计算：

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（1） 按样本蛋白浓度计算：

单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol4-香豆酸辅酶A 定义为一个酶活力单位。

4CL（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10 9]÷(V 样×Cpr) ÷T= 31.75×ΔA÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算：

单位定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol 4-香豆酸辅酶A 定义为一个酶活力单位。

4CL（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10 9]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T= 31.75×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算：

单位定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol 4-香豆酸辅酶A 定义为一个酶活力单位。

4CL（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10 9]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T= 0.063×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2×10 -4 L；ε：4-香豆酸辅酶 A 摩尔消光系数，2.1×10 4 L / mol /cm；

d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；

T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

b. 用 96 孔板测定的计算公式如下

1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol 的 4-香豆酸辅酶A 定义为一个酶活力单位。

4CL（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10 9]÷(V 样×Cpr) ÷T= 63.49×ΔA÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol 4-香豆酸辅酶A 定义为一个酶活力单位。

4CL（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10 9]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T= 63.49×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol 4-香豆酸辅酶A 定义为一个酶活力单位。

4CL（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10 9]÷(500×V 样÷V 样总)÷T= 0.127×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2×10 -4 L；ε：4-香豆酸辅酶 A 摩尔消光系数，2.1×10 4 L / mol /cm；

d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；

T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。