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多胺氧化酶(Polyamine oxidase,PAO)试剂盒说明书

发布时间:2023/11/6点击次数:523

多胺氧化酶(Polyamine oxidasePAO)试剂盒说明书

                                         微量法100/96


   正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:                           

多胺氧化酶是催化生物体内多胺氧化的关键酶,通过调节体内多胺水平和生成物的浓度,参与各种植物体对逆境胁迫的反应和生长发育过程。

 

测定原理:

PAO催化多胺氧化产生过氧化氢,在过氧化物酶存在的条件下与底物显色,在550nm下有特征吸收峰,通过测定吸光值增加速率来反映PAO活性

 

需自备的仪器和用品:

酶标仪、台式离心机、可调式移液器、96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

 

试剂组成和配制:

试剂一:液体120mL×1瓶,4℃保存;

试剂二:液体3mL×1瓶,4℃保存;

试剂三:液体1.5mL×1瓶,4℃保存;

试剂四:液体1.5mL×1瓶,4℃保存。

 

粗酶液提取:

1.        组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)15~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一)进行冰浴匀浆,然后10000g4℃离心20min,取上清,置冰上待测。

2.        细菌、真菌:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~10001的比例(建议500万细胞加入1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后10000g4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。

3.        血清等液体:直接测定。

 

测定步骤:

1、   酶标仪预热30min以上,调节波长至550nm

2、   样本测定

试剂名称(µL

测定管

试剂一

140

试剂二

20

试剂三

10

样本

20

试剂四

10

迅速混匀,于550nm下测定初始吸光值A130min后吸光值A2ΔA=A2-A1

 

PAO活性计算:

1)按样本蛋白浓度计算:

单位定义:每mg组织蛋白在每mL反应体系中每分钟A550变化0.001为一个酶活力单位。

PAOU/mg prot)=ΔA×V反总÷V×Cpr÷0.001÷T =333.33×ΔA÷Cpr

2)按样本鲜重计算:

单位定义:每g组织在每mL反应体系中每分钟A550变化0.001为一个酶活力单位。

PAOU/g 鲜重)=ΔA×V反总÷(W× V÷V样总)÷0.001÷T =333.33×ΔA÷W

3)按细菌或细胞密度计算:

单位定义:每1万个细菌或细胞在每mL反应体系中每分钟A550变化0.001为一个酶活力单位。

PAOU/104 cell)=ΔA×V反总÷(500×V÷V样总)÷0.001÷T =0.667×ΔA

(4)按液体体积计算

单位的定义:每mL液体样本在每mL反应体系中每分钟A550变化0.001为一个酶活力单位。

PAOU/mL=ΔA×V反总÷V÷0.001÷T =333.33×ΔA

V反总:反应体系总体积,0.2mLV样:加入样本体积,0.02 mLV样总:加入提取液体积,1 mLT:反应时间,30 minCpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本质量,g500:细菌或细胞总数,500万。

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