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T7体外转录试剂盒

简要描述:T7体外转录试剂盒是利用T7 RNA Polymerase进行体外转录(in vitro transcription),大量合成siRNA的试剂盒。

  • 更新时间:2022-09-26
  • 厂商性质:生产厂家
  • 生产地址:上海
  • 访  问  量:125

详细介绍

品牌自营品牌CAS/
分子式/纯度详询
分子量/货号YLK10355P
规格50T供货周期现货
主要用途科研应用领域化工,生物产业

T7体外转录试剂盒是利用T7 RNA Polymerase进行体外转录(in vitro transcription),大量合成siRNA的试剂盒。试剂盒使用了T7 RNA Polymerase,以含有T7 Promoter序列的线型双链DNA为模板,可以对Promoter下游的DNA序列进行转录,高效合成单链RNA。试剂盒中附带有Control Template(线型Plasmid DNA),以20 ng的Control Template为模板,在20 μl的转录反应体系中,可以合成约10 μg的2 kb单链RNA。另外,本试剂盒含有RNase T1,该酶可特异性切断单链RNA的鸟苷酸3’端的磷酸。体外转录反应后可以合成siRNA。

(注意)T7体外转录试剂盒适用于合成大量RNA,不推荐用于制作高比活性的RNA probe。

●    保   存:-20℃

●    实验操作注意

1.     反应体系中须严格注意不要混入 RNase。

2.     实验器材(如:枪头、Microtube 等)注意严格使用 RNase Free 用品。

3.     实验操作时请注意戴一次性手套,防止 RNase 污染。


    模板 DNA 的制备

含有 T7 启动子,线性化质粒或 PCR 扩增产物可以作为模板。

T7 启动子序列

23.png

粗体字+1 的 G 开始转录 RNA。

1.   质粒作为模板

向含有 T7 启动子的质粒载体中插入目的 DNA,然后用限制酶进行处理。这时,在启动子区域右侧、插入DNA 片段的下游,使用在插入 DNA 片段中无识别位点的限制酶对质粒进行线性化处理。请使用能形成 5’ 突出或者平滑末端的限制酶。反应结束后,进行 Proteinase K 处理及精制反应。


1)  限制酶反应液中,加入终浓度为 100 μg/ml 的 Proteinase K 与终浓度为 0.5%的 SDS。

2)  37℃反应 30 分钟。

3)  TE 饱和的苯酚/氯仿处理。


4)  加入 1/10 体积的 3 M 醋酸钠及 2.5 倍体积的乙醇进行乙醇沉淀。

5)  离心回收的 DNA 沉淀用 80%乙醇洗净处理。

6)  RNase-free TE Buffer 溶解。


24.png


2.   PCR 扩增产物作为模板

T7 启动子(TAATACGACTCACTATAGGG)添加在 sense primer 的 5’端(这时,在 T7 启动子序列的上游添加 6~10 个核苷酸可以更有效地促进 T7 RNA polymerase 结合并合成 RNA)、或者插入目的片段的质粒 DNA 的 T7 启动子上游设定 sense primer 及 anti-sense primer 进行 PCR 扩增。扩增产物可使用 NucleoSpin Gel and PCR Clean-up(Code No. 740609 .10/.50/.250)进行精制。

25.png

●    DNase 处理

如果想要除去 DNA,转录反应后按下面方法进行 DNase 处理。

(1)   转录反应后,向其中加入 10~20 U/20 μl 反应液的 RNase free DNase I,混匀。

(2) 37℃反应 30 分钟。

    转录 RNA 精制

A.   按照下面方法进行苯酚/氯仿抽提、异丙醇沉淀。

反应液体积低于 100 μl 时,加入 RNase free dH2O 补足至 100 μl。

(1)    加入等体积的苯酚(pH4.5)/氯仿/异戊醇(25:24:1),vortex 搅拌,12,000 rpm 室温离心 2分钟。

(2)    上层(水层)移至新 tube 中,加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1),vortex 搅拌,12,000 rpm室温离心 2 分钟。

(3)    上层(水层)移至新 tube 中,加入 1/10 体积的 3 M 醋酸钠、等体积的异丙醇,充分混合均匀。

(4)    室温放置 5 分钟后,15,000 rpm 室温离心 5 分钟。

(5)    除去上清,80%乙醇洗净沉淀。

(6)    干燥后加入 RNase free dH2O 或者 TE Buffer 溶解沉淀。

(7)    如有必要,可小量分装保存于-20℃~-70℃。

B.  也可以使用下述商业化产品(当 transcript RNA size>200 bases) NucleoSpin RNA Clean-up(740948.10/740948.50/740948.250) NucleoSpin RNA Clean-up XS(740903.10/740903.50/740903.250)

    制作 siRNA

按照下面的方法利用本试剂盒可以制作 siRNA。

〔概要〕

<Step 1>

制备向 T7 启动子序列附加 siRNA 序列的双链 DNA Oligonucleotide 两组。

26.png

●    参考文献

(1)   Davanloo, P., Rosenberg, AH., Dunn, JJ., Studier, FW.Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase. : Proc Natl Acad Sci USA. (1984) 81: 2035-2039.

(2)   Browning, K S. Transcription and translation of mRNA from polymerase chain reaction-generated DNA. Amplifications. (1989) 3: 14-15.

(3)   Schenborn, E T. and Mierendorf Jr, R C. A novel transcription property of SP6 and T7 RNA polymerase : dependence on template structure. Nuc Acids Res. (1985) 13: 6223-6236.

(4)   Heinonen, J E., Smith, CI., and Nore, B F. Silencing of Bruton's tyrosine kinase (Btk) using short interfering RNA duplexes (siRNA). FEBS Letter. (2002) 527: 274-278.


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