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免RNA提取RT-PCR试剂盒

简要描述:免RNA提取RT-PCR试剂盒是一种免 RNA 提取的 RT-PCR 试剂盒,它使用精心优化的细胞裂解液直接裂解培养细胞,然后直接在细胞裂解液中进行 RT,再用 cDNA 进行 PCR 或荧光定量 PCR。

  • 更新时间:2022-09-26
  • 厂商性质:生产厂家
  • 生产地址:上海
  • 访  问  量:128

详细介绍

品牌自营品牌CAS/
分子式/纯度详询
分子量详询货号YLK10357P
规格50T供货周期现货
主要用途科研应用领域化工,生物产业

中文名称:免RNA提取RT-PCR试剂盒

英文名称:Cell Lysate RT-PCR Kit



规格及成分

成 分

十孔盒包装

溶液 A

25 mL

溶液 B

0.5 mL

MMLV 逆转录酶 ( RI)

100 µL

RT Buffer dNTP

300 µL

PCR MagicMix 3.0(含染料)

9 mL

RNase-free

10 mL

使用手册

1

使用方法


注意:无 RNase 的环境和使用无 RNase 污染的试剂是本实验成功的关键。

强烈建议使用优利科的固相 RNase 清除剂去除工作台面的 RNase,用气相

RNase 去除空气中的 RNase。实验前需要将 95%乙醇放-70℃预冷,最好用空枪头盒盛乙醇。

一、细胞培养、裂解

1.     按常规方法培养细胞、胰酶消化并计数。

2.     转移 1×10E5 个细胞到离心管中,400×g 离心 4 分钟。

3.     吸弃上清(即培养基),保留细胞沉淀。

4.     用 0.5 mL 溶液 A 重悬细胞,并将细胞浓度调整到 2×10E5 细胞/mL。

5.     转移 10 µL 的悬浮细胞到 0.2 mL PCR 管中,并加入 10 µL 的溶液 B,此时细胞终浓度为 10E5 细胞/mL。

6.     迅速将离心管插入浮子中,放入-70℃预冷的、95%乙醇中 1-3 分钟。10 µL 枪头盒一般能让 0.2 mL 的 PCR 管一半没入到乙醇中。

7.     在室温的水浴锅中快速解冻细胞,涡旋 10 秒后短暂离心数秒,将管中液体

(细胞裂解液)转移到新的离心管中,放冰上待用。

二、RT(逆转录)反应合成 cDNA

8.     按下表设置 RT 反应体系20 µL 体系为例:

 

成分

样品管

阴性对照管

细胞裂解液(含 RNA

2.5 µL

2.5 µL

RT Buffer dNTP

6 µL

6 µL

MMLV 逆转录酶( RI

2 µL

RT 引物(100ng/µL)

1 µL

1 µL

RNase-free

补水到 20 µL

补水到 20 µL

9.     42保温 60 分钟。此步为 RT 反应。

10.     70保温 10 分钟以终止反应,然后放冰上待用。合成的 cDNA 可以直接作PCR 模板使用,不需要纯化。也可以放置在-20℃长期保存。

三、PCR 方案一(RT 产物全部用于 PCR)

11.     在上步的 RT 反应管中直接按下表加入各成分(100 µL 体系为例):

 

成分

每管加入量

PCR MagicMix 3.0(已加染料

50 µL

自备正向 PCR 引物 (100 ng/µL)

2 µL

RNase-free

补水到 100 µL

12.     直接进入第 14 步。

四、PCR 方案二(部分 RT 产物用于 PCR

13.    按下表设置 PCR 反应体系(以 30 µL 体系为例):

成分

每管加入量

PCR MagicMix 3.0(已加染料

15 µL

cDNA 样品RT 反应产物)

1-5 µL

自备正向 PCR 引物 (100 ng/µL)

1 µL

自备反向 PCR 引物 (100 ng/µL)

1 µL

RNase-free

补水到 30 µL

注意:RT 引物可以用做反向 PCR 引物。

14.    PCR 反应参数(需要根据模板和引物 Tm 值决定,下面的参数只做参考):

过程

温度

时间

预变性

94℃

5 min

 

PCR 反应

35 个循环)

94℃

1 min

55℃

1 min

72℃

2 min

最后延伸

72℃

10 min

 

五、电泳检测

15.    取 5-10 µL PCR 产物直接在琼脂糖凝胶上电泳,跟分子量标准比较估计出扩增产物的大小。注:本试剂盒中的 PCR mix 含有甘油和染料,可以直接上样,不需要额外再加电泳上样液。


免RNA提取RT-PCR试剂盒特点如下:

1.     免 RNA 提取,从细胞裂解到 RT-PCR 或实时定量 RT-PCR 结果只需三个步骤,省略了整个 RNA 提取过程。

2.     灵敏度不低于常规方法(先提总 RNA 再进行 RT-PCR),不但可以检测到低拷贝的 RNA,还可用于检测 miRNA。

3.     整合了去除基因组 DNA 的步骤,只检测 RNA,无需担心基因组 DNA 的污染。

4.     每次只需要 10-100000 个培养细胞或含相应细胞数的痕量组织(如 LCM 样品),验证过的细胞包括 Hela、CHO、293、COS-7 等,但不能用于 U937 细胞系。

5.     两步法 RT-PCR,后续使用灵活。得到的 cDNA 既可用于普通 PCR,也可用于基于 SYBR 的荧光定量 PCR,也可用于其他定量 PCR(如 TaqMan), 非常灵活。

6.     即适用于少量样品,也适用于平行处理大量样品及高通量筛查。

7.     本产品足够用于 50 次 20µL 体系的 RT 和 600 次 30µL 体系(或约 200 次100µL 体系)的 PCR。


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