两管式RT-PCR试剂盒（AMV-Taq）

中文名称：两管式RT-PCR试剂盒（AMV-Taq）

英文名称：Two-Tube  RT-PCR Kit（AMV-Taq）

本产品使用重组禽类成髓纤维病毒逆转录酶(Avian Myeloblastosis Virus Reverse Transcriptase, AMV RT)，从总 RNA 或者 Poly(A)+ RNA 合成第一链 cDNA 的试剂盒，含有 cDNA 第一链合成所需的所有试剂。AMV RT 具有 RNA 聚合酶活性和 RNase H 的活性，能够作用于 GC 含量高，二级结构复杂的 RNA。合成的第一链 cDNA 可广泛应用于第二链合成、杂交、PCR 扩增、Real-time PCR 反应等。

包装及成分：

两管式RT-PCR试剂盒（AMV-Taq）具有以下特点：

1.即开即用，足够 50 次 RT 反应（20μL 体系）和 600 次 PCR 反应（30μL 体系）。

2.cDNA 第一链合成试剂盒可灵活选用随机引物、Oligo dT 引物或基因专一引物，适合各种情况。

3. 两管式操作，RT 和 PCR 在不同试管中进行，便于单独优化 RT 反应或 PCR 反应条件。

4.全长的第一链 cDNA 产量高，最长可合成 8 kb 的 cDNA。

注意事项： 

1.RNA 样品要避免基因组 DNA 污染。用于 cDNA 合成的器具须用 0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液 37℃浸泡 12 h；然后在 120℃高压灭菌 30 min 去除残留的 DEPC。

2. 用于 RNA 实验的试剂，须使用干热灭菌(180℃，60 min)或者上述 DEPC 处理的器具盛装，使用的无菌水须用 0.1% DEPC 处理后进行高温高压灭菌。建议 RNA 实验使用的器具、试剂和无菌水专用。

3. 不必从总 RNA 中分离 Poly(A)+ mRNA，但以 Poly(A)+ mRNA 为模板可以提高终产物得率和纯度。

4. 尽管以 Oligo dT 作引物无需优化，但随机六合引物和 RNA 的比例对于 cDNA 合成产物的平均长度非常关键，提高随机六合引物/RNA 的比值将导致短链 cDNA (500 bp)产量升高而减少，此比值则有利于长链 cDNA 的合成。

5. 提高反应温度到 50℃有利于解决富含 GC 二级结构的 mRNA 问题。AMV RT 的热稳定性相对于 M-MuLV 较好，在 37-50℃有较高活性。

6. cDNA 产物应置于-20℃保存。实验操作时应将酶置于冰上，实验结束后于-20℃保存。

常见问题：

1.    反转录引物的选择

a.    用于第一链 cDNA 合成的引物，oligo dT 有利于长链 cDNA 的合成，使用该引物只需42℃进行反转录即可，无需 25℃预热。

b.    随机引物适合于 500 bp 以下的短链 cDNA 的合成，所转录的 RNA 模板无需 poly(A)尾，可转录 5'端区域。使用该引物前须将引物进行 25℃温浴。

c.    基因特异性引物主要用于合成特定基因片段长度的 cDNA。

2.   第一链 cDNA 合成原理及产物检测

a. cDNA 的合成是以 mRNA 为模板，以随机引物或者基因特异性引物或者 oligo dT 为引物，在反转录酶的催化下从 5'→3'合成第一链 cDNA。