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柠檬酸合酶(citrate synthase,CS)试剂盒

简要描述:CS(EC 2.3.3.1)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中,是三羧酸循环第一个限速酶,是三羧酸循环主要调控位点之一。柠檬酸合酶(citrate synthase,CS)试剂盒现货供应。

  • 更新时间:2023-07-09
  • 厂商性质:生产厂家
  • 生产地址:上海
  • 访  问  量:508

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详细介绍

品牌YLKBIOCAS详见说明书
分子式详见说明书纯度详见说明书
分子量详见说明书货号YLK-SH115
规格100管/48样、50管/24样、25管/12样供货周期现货
主要用途科研应用领域化工,生物产业
测定方法:微量法、可见分光光度法

柠檬酸合酶(citrate synthaseCS)试剂盒说明书

                                        微量法100/48

   正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:                          

CSEC 2.3.3.1)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中,是三羧酸循环第一个限速酶,是三羧酸循环主要调控位点之一。

测定原理:

CS催化乙酰CoA和草酰乙酸产生柠檬酰辅酶/A,进一步水解产生柠檬酸;该反应促使无色的DTNB转变成黄色的TNB,在 412nm处有特征吸光值。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰、无水乙醇和蒸馏水

试剂组成和配制:

试剂一:液体100mL×1瓶,-20保存;

试剂二:液体20mL×1瓶,-20保存;

试剂三:液体1.5mL×1支,-20保存;

试剂四:液体28mL×1瓶,4保存;

试剂五:粉剂×1瓶,4保存;

试剂六:粉剂×1支,-20保存,临用前加入1.2mL蒸馏水,用不完的试剂仍-20保存;

样本的前处理:

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

       称取约0.1g组织或收集500万细胞,加入1mL试剂一和10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

       将匀浆600g4离心5min

       弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g4离心10min

       上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的CS(此步可选做)。

       在步骤④的沉淀中加入200uL试剂二和2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3秒,间隔10秒,重复30次),用于线粒体CS测定。

测定步骤:

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至412nm,蒸馏水调零。

2、样本测定

1)在试剂五中加入0.6mL无水乙醇和13mL试剂四,混匀,37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)孵育5min用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融

2测定管:在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、220μL试剂五10μL试剂六,混匀,37℃反应15min后立即测定吸光值A1

3对照管:在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、220μL试剂四10μL试剂六,混匀,37

反应15min后立即测定吸光值A2

4计算ΔA=A1-A2,每个测定管设一个对照管。

CS活性计算:

a.        使用微量石英比色皿测定的计算公式如下:

1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。

CSnmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=117.6×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。

CSnmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V反总÷ε×d×109W× V÷V样总)÷T=23.8×ΔA÷W

3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。

CSnmol/min /104 cell=[ΔA×V反总÷ε×d×109500×V÷V样总)÷T=0.0475×ΔA

V反总:反应体系总体积,2.4×10-4 LεTNB摩尔消光系数,1.36×104 L / mol /cmd:比色皿光径,1cmV样:加入样本体积,0.01 mLV样总:加入提取液体积,0.202 mLT:反应时间,15 minCpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本质量,g500:细胞或细菌总数,500万。

b.       使用96孔板测定的计算公式如下:

1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。

CSnmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=235.3×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。

CSnmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V反总÷ε×d×109W ×V÷V样总)÷T=47.5×ΔA÷W

3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。

CSnmol/min /104 cell=[ΔA×V反总÷ε×d×109500×V÷V样总)÷T=0.095×ΔA

V反总:反应体系总体积,2.4×10-4 LεTNB摩尔消光系数,1.36×104 L / mol /cmd96孔板光径,0.5cmV样:加入样本体积,0.01 mLV样总:加入提取液体积,0.202 mLT:反应时间,15 minCpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本质量,g500:细胞或细菌总数,500万。

柠檬酸合酶(citrate synthaseCS)试剂盒仅供科研!


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