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硫氧还蛋白过氧化物酶(TPX)试剂盒说明书

发布时间:2023/11/8      点击次数:694

硫氧还蛋白过氧化物酶(TPX)活性测定试剂盒说明书

 

                         微量法 100T/96S

 

 

 

注 意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

 

 

测定意义:

 

TPX 属于过氧化物酶家族,在体内主要通过还原过氧化氢和一些氢过氧化物来实现抗氧化作用,功能与 GPX 类似,也是谷胱甘肽氧化还原循环关键酶之一。TPX 普遍存在于各种生物体内,如酵母、植物、动物、原生动物、寄生虫、细菌和古细菌,在进化上高度保守。 TPX 与细胞增殖、分化、细胞凋亡及肿瘤发生调控密切相关。TPX 的主要功能包括细胞脱毒、抗氧化和调节由过氧化氢介导的信号转导和免疫反应。

 

 

测定原理:

 

TPX 催化 H2O2 氧化二硫苏糖醇(DTT),H2O2 的吸收波长为 240nm,通过测定 240nm 吸光度的下降速率,即可计算出 TPX 活性。

 

 

自备仪器和用品:

 

低温离心机、水浴锅、可调节移液器、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板(UV板)、和蒸馏水

 

 

试剂组成和配制:

 

试剂一:液体 120mL×1 瓶,室温保存。

 

试剂二:液体 20mL×1 瓶,- 20保存。

 

试剂三:液体 2mL×1 支,4

 

 

粗酶液提取:

 

1.        组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL) 15~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一)进行冰浴匀浆。8000g4离心 10min,取上清置冰上待测。

 

2.        细菌、真菌:按照细胞数量(104 个):试剂一体积(mL)为 500~10001 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);然后 8000g4,离心 10min,取上清置于冰上待测。

 

3.        血清等液体:直接测定。

 

 

TPX 测定操作:

 

取微量石英比色皿或 96 孔板,加入 4 μL 上清液,180 μL 试剂二,16 μL 试剂三,迅速混匀后于 240 nm 测定 10s 130s 吸光度,记为 A1 A2

 

 

TPX 活性计算公式:

 

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

 

(1). 按蛋白浓度计算

 

活性单位定义:25或者 37中,每毫克蛋白每分钟催化 1nmol H2O2 降解为 1 个酶活单位。TPXnmol/min /mg prot=(A1A2)÷ε÷d×V 反总÷Cpr×V 样)÷T

 

=573×(A1A2)÷Cpr

 

(2). 按样本质量计算

 

活性单位定义:25或者 37中,每克样本每分钟催化 1nmol H2O2 降解为 1 个酶活单位。 TPX 活性(nmol/min/g 鲜重)=(A1A2)÷ε÷d×V 反总÷(W×V ÷V 样总)÷T

 

=573×(A1A2)÷W

 

3)按细胞数量计算

 

活性单位定义:25或者 37中,每 104 个细胞每分钟催化 1nmol H2O2 降解为 1 个酶活单位。


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