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总抗氧化能力 (ABTS 法)试剂盒说明书

发布时间:2023/11/9      点击次数:593

总抗氧化能力 (ABTS 法)试剂盒说明书

 

微量法 100T/96S

 

 

注 意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

 

 

研究意义:

 

测定对象中各种抗氧化物质和抗氧化酶等构成总抗氧化水平。在生物学、医学和药学研究中常常检测血浆、血清、唾液、尿液等各种体液,细胞或组织等裂解液、植物或中草药抽提液及各种抗氧化物(antioxidant)溶液的总抗氧化能力。

 

 

测定原理:

 

ABTS 法是使用Z广泛的间接检测方法,可用于亲水性和亲脂性物质抗氧化能力测定。ABTS经氧化后生成稳定的蓝绿色阳离子自由基 ABTS+,能溶于水相或酸性乙醇介质中,在 734nm 处有最大吸收。被测物质加入 ABTS+溶液后,所含抗氧化成分能与 ABTS+发生反应而使反应体系褪色。在 734nm 检测吸光度的变化,并以 Trolox 作为对照体系量化抗氧化物质的抗氧化能力。

 

 

自备实验用品:

 

恒温水浴锅、低温离心机、酶标仪、96 孔板和蒸馏水。

 

 

试剂组成和配制:

 

提取液:液体 120mL×1 瓶,4℃保存。

 

试剂一:液体 24mL×1 瓶,4℃避光保存。

 

试剂二:粉剂×2 瓶,4℃避光保存。

 

 

样品的制备:

 

(1)     血清、血浆、唾液或尿液等液体样品

 

血浆(制备时可以使用肝素或柠檬酸钠抗凝,不宜使用 EDTA  抗凝)4℃,5000rpm 离心

 

10min,取上清待测。血清、唾液或尿液样品直接用于测定,也可以-80℃冻存(不宜超过

 

30   d)后再测定。

 

(2) 组织样品

 

按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液)进行冰浴匀浆,然后 10000g,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

 

(3) 细胞样品

 

按照细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 提取液),冰浴超声波破碎(功率 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);10000g,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

 

 

操作步骤:

 

1、 酶标仪预热 30min,调节波长至 734nm。

 

2、 工作液的配置:临用前取试剂二一瓶,加入 11mL 试剂一,震荡混匀 20min 后,静置,

 

取上清使用。(注意,现配现用)

 

3、操作表(在 EP 管中反应)

 



空白管

测定管




提取液(μL)

10





样品(μL)


10




工作液(μL)

190

190




充分混匀,10min 内测定 734nm 吸光值,△A= A 空白-A 测定

 

注意:空白管只需测定一次,吸取工作液时不要吸到底部沉淀,若 A 测定小于 0.4,需用提取


液稀释后检测。

 

总抗氧化能力计算公式:

 

1、以自由基清除率表示:

 

ABTS 自由基清除率(%)=(A 空白-A 测定)÷A 空白×100%

 

2、以标准曲线上获得的抗氧化剂 Trolox 的量表示:

 

标准曲线:y = 0.7021x - 0.0012                R2 = 0.9985                 x:Trolox 浓度(μmol/mL)

y:吸光值差值△A

 

单位定义:以标准曲线上获得的抗氧化剂 Trolox 的量来表示样本的 ABTS 自由基清除能力。(1)按样本质量计算

 

总抗氧化能力(μmol Trolox/g 鲜重)=(△A+0.0012)÷0.7021×V 样÷(V 样÷V 样总×W) =1.424×(△A+0.0012)÷W

 

(2)按样本蛋白浓度计算

 

总抗氧化能力(μmol Trolox/mg prot)=(△A+0.0012)÷0.7021×V 样÷(V 样÷V 样总×Cpr) =1.424×(△A+0.0012)÷Cpr

 

(3)   按细胞计算

总抗氧化能力(μmol Trolox/104cell)=(△A+0.0012)÷0.7021×V 样÷(V 样÷V 样总×细胞

数量(万个))

= 1.424×(△A+0.0012)÷ 细胞数量(万个)

 

(3)按液体体积计算

 

总抗氧化能力(μmol Trolox/mL)=(△A+0.0012)÷0.7021 =1.424×(△A+0.0012)

 

V   样总:加入提取液体积,1 mL;V 样:反应中样品体积,10μL;W:样品质量,g;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL

 

注意事项:

 

1.        尽量避免使用在中碱性条件下呈蓝色或接近蓝色的试剂,否则对本试剂盒的检测结果产生干扰。

 

2.        样品中不宜添加 Tween、Triton 和 NP-40 等去垢剂和 DTT、巯基乙醇等影响氧化还原反应的还原剂。


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