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单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)测定试剂盒

简要描述:单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)测定试剂盒测定意义:MDHAR 催化 MDHA 还原生成 AsA,在抗坏血酸氧化还原代谢中具有重要作用。

  • 更新时间:2023-07-09
  • 厂商性质:生产厂家
  • 生产地址:上海
  • 访  问  量:1131

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详细介绍

品牌YLKBIOCAS详见说明书
分子式详见说明书纯度详见说明书
分子量详见说明书货号YLK-SH113
规格100管/96样、50管/48样供货周期现货
主要用途科研应用领域化工,生物产业
测定方法:微量法、紫外分光光度法

单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)测定试剂盒说明书

 

微量法100T/96S

 

 

注 意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

 

 

测定意义:

 

MDHAR 催化 MDHA 还原生成 AsA,在抗坏血酸氧化还原代谢中具有重要作用。

 

 

测定原理:

 

MDHAR 催化 NADH 还原 MDHA 生成 AsA NAD+NADH 340 nm 有特征吸收峰,但是 NAD+没有。通过测定 340 nm 光吸收下降速率,来计算出 MDHAR 活性。

实验中所需仪器及设备:

 

研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、可调式移液枪和双蒸水

 

 

试剂组成和配置:

 

试剂一:液体 100mL×1 瓶,4保存。

 

试剂二:液体 20mL×1 瓶,室温保存。

 

试剂三:粉剂×1 瓶(棕色),4保存。临用前加入 3 mL 蒸馏水充分溶解。

 

试剂四:粉剂×1 瓶,4保存。临用前加入 2.5 mL 蒸馏水充分溶解。

 

试剂五:液体 15μL×1 瓶,4保存。临用前加 3 mL 试剂二充分溶解。

 

 

粗酶液提取:

 

1.        组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL) 15~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一)进行冰浴匀浆。8000g4离心 10min,取上清置冰上待测。

 

2. . 细菌、真菌:按照细胞数量(104 个):试剂一体积(mL)为 500~10001 的比例(建

 

500 万细胞加入 1mL 试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);8000g 4离心 20min,取上清液置冰上混匀待测。

 

3.        血清等液体:直接测定。

 

 

MDHAR 测定操作:

 

1.    分光光度计/酶标仪预热 30 min,调节波长到 340 nm,蒸馏水调零。

 

2.    试剂二在 25水浴锅中预热 30 min

 

3.依次在微量石英比色皿/96 孔板中加入 20μL 试剂三、20μL 试剂四、20μL 试剂五和 120μL 试剂二,最后加入 20μL 上清液,迅速混匀后于 340nm 比色,记录 30s 150s 的吸光值 30s

 

150s 的吸光值 A1 A2A=A1-A2

 

 

MDHAR 活性计算公式:

 

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

 

(1). 按蛋白浓度计算

 

MDHAR 活性单位定义:25中每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol NADH 1 个酶活单位。 MDHAR (nmol/min /mg prot) = A÷ε÷d×V 反总×109Cpr×V 样)÷T

 

= 804×A ÷Cpr

 

(2). 按样本质量计算

 

MDHAR 活性单位定义:25中每克样本每分钟氧化 1nmol NADH 1U MDHAR (nmol/min /g 鲜重) = A÷ε÷d×V 反总×109W×V ÷V 样总)÷T

 

= 804×A ÷W

 

3)按细胞数量计算

 

 

MDHAR 活性单位定义:25中每 104 个细胞每分钟氧化 1nmol NADH  1 个酶活单位。

MDHAR (nmol/min/104 cell) = A÷ε÷d×V 反总×109÷(细胞数量×V ÷V 样总)÷T = 804×A ÷ 细胞数量

 

4)按液体体积计算

 

MDHAR 活性单位定义:25中每毫升液体每分钟氧化 1nmol NADH 1 个酶活单位。 MDHAR (nmol/min /mL) = A÷ε÷d×V 反总×109÷V 样)÷T

 

= 804×A

 

εNADH 摩尔消光系数,6220 L/mol/cmd:比色皿光径,1cmV 反总:反应体系总体积,0.2mL=2×10-4LV 样:加入反应体系中上清液体积,20μL=0.02mLV 样总:提取液体积,

1  mLCpr:上清液蛋白浓度,mg/mL,蛋白质浓度需要另外测定,建议使用本公司蛋白质含量 BCA 试剂盒;W :样品质量;T:反应时间,2min

 

b.使用 96 孔板测定的计算公式如下:

 

(1). 按蛋白浓度计算

 

MDHAR 活性单位定义:25中每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol NADH 1 个酶活单位。 MDHAR (nmol/min /mg prot) = A÷ε÷d×V 反总×109Cpr×V 样)÷T

 

= 1608×A ÷Cpr

 

(2). 按样本质量计算

 

MDHAR 活性单位定义:25中每克样本每分钟氧化 1nmol NADH 1U MDHAR (nmol/min /g 鲜重) = A÷ε÷d×V 反总×109W×V ÷V 样总)÷T

 

= 1608×A ÷W

 

3)按细胞数量计算

 

MDHAR 活性单位定义:25中每 104 个细胞每分钟氧化 1nmol NADH 1 个酶活单位。 MDHAR (nmol/min/104 cell) = A÷ε÷d×V 反总×109÷(细胞数量×V ÷V 样总)÷T

= 1608×A ÷  细胞数量

 

4)按液体体积计算

 

MDHAR 活性单位定义:25中每毫升液体每分钟氧化 1nmol NADH 1 个酶活单位。 MDHAR (nmol/min /mL) = A÷ε÷d×V 反总×109÷V 样)÷T

 

=1608×A

 

εNADH 摩尔消光系数,6220 L/mol/cmd96 孔板光径,0.5cmV 反总:反应体系总体积,0.2mL=2×10-4LV 样:加入反应体系中上清液体积,20μL=0.02mLV 样总:提取液体积,1 mLCpr:上清液蛋白浓度,mg/mL,蛋白质浓度需要另外测定,建议使用本公司蛋白质含量 BCA 试剂盒;W :样品质量;T:反应时间,2min

 

单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)测定试剂盒注意事项:

 

临用前配制的试剂未使用完的 4保存,3 天内使用完。

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