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辅酶ⅠNAD(H)含量试剂盒

简要描述:辅酶ⅠNAD(H)含量试剂盒分别用酸性和碱性提取液提取样品中NAD+和NADH,NADH通过PMS的递氢作用,还原氧化型噻唑蓝(MTT)为甲瓒,在570nm下检测吸光值;而NAD+可被乙醇脱氢酶还原为NADH,进一步采用MTT还原法检测。

  • 更新时间:2023-07-09
  • 厂商性质:生产厂家
  • 生产地址:上海
  • 访  问  量:1153

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详细介绍

品牌YLKBIOCAS详见说明书
分子式详见说明书纯度详见说明书
分子量详见说明书货号YLK-SH108
规格100管/48样、50管/24样供货周期现货
主要用途科研应用领域化工,生物产业
测定方法:微量法、可见分光光度法

辅酶ⅠNAD(H)含量试剂盒说明书

                                        微量法100/48

 

   正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

辅酶ⅠNAD(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,NAD+是糖酵解(EMP)和三羧酸循环(TCA)的主要氢受体,生成的NADH经呼吸电子链(ETC)传递把电子交给氧,在合成ATP的同时,形成大量的ROS,同时NADH再生为NAD+。糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分通过这一体系完成。NAD(H)含量和NADH/NAD+比值的高低可用于评价糖酵解和TCA循环的强弱。较高的NAD(H)NADH/NAD+比值说明细胞呼吸耗氧量较高,处于过氧化状态。此外,NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和TCA循环。另外,NAD+降解产物对细胞信号传导、代谢和基因表达等具有重要的调控作用。

 

测定原理

分别用酸性和碱性提取液提取样品中NAD+NADHNADH通过PMS的递氢作用,还原氧化型噻唑蓝(MTT)为甲瓒,在570nm下检测吸光值;而NAD+可被乙醇脱氢酶还原为NADH,进一步采用MTT还原法检测。

 

需自备的仪器和用品

酶标仪、台式离心机、移液器、96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

 

试剂的组成和配制

酸性提取液:液体50mL×1瓶,4保存;

碱性提取液:液体50mL×1瓶,4保存;

试剂一:液体10 mL×1瓶,4保存;

试剂二:液体3 mL×1瓶,4保存;

试剂三:粉剂×1瓶,-20 保存,用时加入3mL蒸馏水,混匀,用不完的试剂4保存一周;

试剂四:粉剂×1瓶,4 保存,用时加入3mL蒸馏水,混匀,用不完的试剂4保存一周;

试剂五:液体3.6mL×1瓶,4 保存;

试剂六:液体30mL×1瓶,4 保存;

试剂七:液体50mL×1瓶,4 保存。

 

NAD+NADH的提取

1 血清(浆)中NAD+NADH的提取

NAD+的提取:按照血清(浆)体积(mL):酸性提取液体积(mL)为15~10的比例(建议取约0.1mL血清(浆),加入1mL酸性提取液),95℃水浴5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 离心10min;取500μL上清液,加入500μL碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 离心10min,取上清,置冰上待测。

NADH的提取:按照血清(浆)体积(mL):碱性提取液体积(mL)为15~10的比例(建议取约0.1mL血清(浆),加入1mL碱性提取液),95℃水浴5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 离心10min;取500μL上清液,加入500μL酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 离心10min,取上清,

 

冰上待测。

2组织中NAD+NADH的提取

NAD+的提取:按照组织质量(g):酸性提取液体积(mL)为15~10的比例(建议取约0.1g组织,加入1mL酸性提取液),冰浴研磨,95℃水浴5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 离心10min;取500μL上清液,加入500μL碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 离心10min,取上清,置冰上待测。

NADH的提取:按照组织质量(g):碱性提取液体积(mL)为15~10的比例(建议取约0.1g组织,加入1mL碱性提取液),冰浴研磨,95℃水浴5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 离心10min;取500μL上清液,加入500μL酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 离心10min,取上清,置冰上待测。

3 细胞或细菌中NAD+NADH的提取

NAD+的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量(104个):酸性提取液体积(mL)为500~10001的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL酸性提取液),超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次),95℃水浴5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 离心10min;取500μL上清液,加入500μL碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 离心10min,取上清,置冰上待测。

NADH的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量(104个):碱性提取液体积(mL)为500~10001的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL碱性提取液),超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次),95℃水浴5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 离心10min;取500μL上清液,加入500μL酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 离心10min,取上清,置冰上待测。

 

测定步骤:

1、   分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至570nm,蒸馏水调零。

2、   加样表(1.5mL棕色EP管中按下表依次加样):

试剂名称(μL)

对照管

测定管

样本

20

20

试剂一

80

80

试剂二

30

30

试剂三

30

30

试剂四

30

30

试剂五

30

30

试剂六

200

混匀,室温避光静置20min

试剂六


200

充分混匀,静置5min后,20000g25离心5min,弃上清,沉淀中加入:

试剂七

400

400

混匀,取200μL转移至微量石英比色皿或96孔板中,570nm下读取对照吸光值A1和测定管吸光值A2,计算A=A2-A1

 

注意事项

1、如果一次性测定样本数较多,可将试剂一、二、三和四按比例配成混合液。

2、对照管和测定管的测定步骤的区别:对照管加完试剂一、二、三、四和五后必须马上加试剂六;测定管

 

加完试剂一、二、三、四和五后必须反应20min后再加试剂六。

3、反应过程中注意避光。

4、若NAD+测定中△AA2-A1)≤0.0302NADH测定中△AA2-A1)≤0.0222说明样本中辅酶含量较低,已低于检测限,可做如下调整:(1)将测定管避光静置时间20min延长到60min;(2)在提取阶段增加取样量,即取0.2g样本或0.2mL样本加入1mL提取液。

5、由于每一个测定管需要设一个对照管,本试剂盒100管保证测48NAD+NADH.

 

NAD+NADH含量的计算

(一)      NAD+含量的计算

标准条件下的回归曲线为y = 0.1475x + 0.0302R2 = 0.9978;其中yAxNAD+浓度nmol/mL

1、血清(浆)中NAD+含量计算

NAD+含量(nmol/mL=[(A -0.0302÷0.1475×V1) ]÷(V3×V1÷V2)=135.6×(A -0.0302

2、组织、细菌或细胞中NAD+含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算

NAD+ (nmol/mg prot=[(A -0.0302÷0.1475×V1)]÷(V1×Cpr)= 6.8×(A -0.0302÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

NAD+ (nmol/g 鲜重= [(A -0.0302÷0.1475×V1)]÷(W×V1÷V2)= 13.6×(A -0.0302÷W

 (3)按细菌或细胞密度计算

NAD+ (nmol/104 cell=[(A -0.0302÷0.1475×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.027×(A -0.0302

 

(二)NADH含量的计算

标准条件下的回归曲线为y = 0.1404x + 0.0222R2 = 0.9976其中yAxNADH浓度nmol/mL

1、血清(浆)中NADH含量计算

NADH含量(nmol/mL= [ (A -0.0222÷0.1404×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 142.5×(A -0.0222

2、组织、细菌或细胞中NADH含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算

NADH (nmol/mg prot= [ (A -0.0222÷0.1404×V1) ]÷(V1×Cpr)= 7.1×(A -0.0222÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

NADH (nmol/g 鲜重=[(A -0.0222÷0.1404×V1) ]÷(W×V1÷V2)= 14.2×(A -0.0222÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

NADH (nmol/104 cell= [ (A -0.0222÷0.1404×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.028×(A -0.0222

 

V1:加入反应体系中样本体积,0.02mLV2加入提取液体积,2mLV3:加入血清(浆)体积:0.1mLCpr:样本蛋白质浓度,mg/mL W:样本质量,g500:细胞或细菌总数,500万。

辅酶ⅠNAD(H)含量试剂盒 意:Z低检测限为0.1nmol/mL0.1nmol/g鲜重 0.001nmol/mg prot

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