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偷死野田村病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

简要描述:偷死野田村病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒偷死野田村病毒(Covert Mortality Nodavirus,CMNV)是一种RNA病毒,主要感染对虾,常出现虾头发黑死亡,会通过水质横向传播,对养殖业危害巨大,因此灵敏快捷的诊断产品具有重要的意义。本产品基于PCR原理开发。

  • 更新时间:2024-04-16
  • 厂商性质:生产厂家
  • 生产地址:上海
  • 访  问  量:63

详细介绍

品牌YLKBIO货号YLK10369P
规格50T供货周期现货
主要用途科研实验应用领域化工,生物产业
英文名称Covert Mortality Nodavirus(CMNV) SYBR qRT-PCR Kit保存条件低温运输,-20℃保存
有效期12个月试剂盒说明不同批号的试剂盒组分不可交互使用

偷死野田村病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒


商品名称:偷死野田村病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

Name     :Covert Mortality Nodavirus(CMNV) SYBR qRT-PCR Kit

偷死野田村病毒(Covert Mortality Nodavirus,CMNV)是一种RNA病毒,主要感染对虾,常出现虾头发黑死亡,会通过水质横向传播,对养殖业危害巨大,因此灵敏快捷的诊断产品具有重要的意义。本产品基于PCR原理开发。它具有下列特点:

1. 一站式,用于不需要单独准备每种成分,包括引物和对照。

2.根据偷死野田村病毒的保守基因序列设计的引物,具有良好的特异性。

3.基于染料法qRT-PCR检测,灵敏度比常规RT-PCR高10-100倍,可以达到至少1000拷贝/反应。

4.使用一管式qRT-PCR技术,RT和PCR两步在一个试管内完成,不需要中间转移样品,降低了操作误差和可能的污染。

5.本产品足够50次30μL体系的RT-PCR,只能用于科研,不能用于临床。

【试剂组成】

 

十孔盒包装

2×qRT-PCR 缓冲液

500 μL(棕色管)

10×qRT-PCR酶混合液

100 μL(红盖)

 ROX染料I

50 μL(棕色管)

ROX染料II

50   μL(棕色管)

荧光PCR专用模板稀释液

1mL(亮黄盖)

偷死野田村病毒RT-PCR引物混合液

100   μL(白盖)

偷死野田村病毒RT-PCR阳性对照

1×10E8拷贝/μL

50   μL(黄盖)

核酸释放剂试用装

20次(1mL,绿盖)

使用手册

1

【储存条件及有效期】

低温运输,-20℃保存,保存期限为12个月。阳性对照需要因易污染其他成分需要单独放置。本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供RNA片段作为阳性对照。


【自备试剂】样品RNA


【使用方法】

一、稀释阳性对照(以10E2-10E7610倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原。

1.       标记6个离心管,分别为765432。用带芯枪头分别加入45 μL 荧光PCR专用模板稀释液,最好用带芯枪头,下同)。

2.      7号管中加入5 μL 1×10E8拷贝/μL 的阳性对照(本试剂盒提供),充分震荡1分钟,得1×10E7拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

3.      换枪头,在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×10E6拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

4.      换枪头,在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×10E5拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品RNA的制备

5.       如果有N个样品,必须设置N+2个提取,多出的一个是PC(样品制备阳性对照),一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上步制备的阳性对照梯度稀释液中的第4号(浓度为1×10E4拷贝/μL10μL相当于1万拷贝)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样,样品体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。

6.      用自选方法纯化N+2个样品的RNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容。

三、设置RT-PCR反应(20μL体系,在样品制备室进行)

如果做定量分析并且只做1次重复,则标记N+9PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR阴性对照,6个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做1次重复,则标记N+4PCR

7.       管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR阴性对照(用水做模板),1个用于PCR阳性对照(用第4号阳性对照稀释液做模板)。下面只描述定量分析的步骤,定性分析只是把6个标曲反应缩减成1个,其余不变。

8.      在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加):

成分

N+2个制备所得样品

RT-PCR阴性对照

RT-PCR阳性

对照(2-7管)

2×qRT-PCR 缓冲液

10μL

10μL

10μL

口蹄疫病毒RT-PCR

引物混合物

2μL

2μL

2μL

50×ROX (见注)

0.4μL

0.4μL

0.4μL

 样品制备所得RNA模板(来于第8步)

5.6μL

不加

不加

稀释所得6个阳性对照(来于第6步)

不加

不加

5.6μL2号样到2号管,3号样到3号管

10×qRT-PCR

酶混合液

2μL

2μL

2μL

:需使用ROX染料I的机型:ABI Prism7000730077007900HTStep-OneStep-One Plus需使用ROX染料II的机型::ABI Prism 75007500FastMJ ResearchChromo4OpticonIICorbett Rotor Gene 3000

不需要使用ROX的机型:Thermal Cycle Dice Real Time System LightCyclerSmart Cycler SystemAgilent Mx3000PRotorGene 3000RotorGene 6000

9.       上机后按下面参数进行RT-PCR(参数可能会因仪器不同而需优化)。


过程

温度

时间

RT(逆转录)

50℃

15-30分钟

预变性

94℃

2分钟

RT - PCR反应

30个循环)

95℃

15

60

15 秒(采集FAM通道的荧光信号)

72

15

按仪器预设程序进行溶解曲线分析








四、数据处理

10.       如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的log值为横轴,以Ct值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值,再推算出其浓度。

11.       如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct值应该小于或等于30。对待测样品,如果其Ct大于或等于40则为阴性,如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间,则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性,如果小于40,则为阳性。

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