立克次氏体通用探针法荧光定量PCR试剂盒

立克次氏体通用探针法荧光定量PCR试剂盒

商品名称：立克次氏体通用探针法荧光定量PCR试剂盒

Name     ：Rickettsia spp. Probe qPCR Kit

立克次氏体（Rickettsia）为革兰氏阴性菌，是一类专性寄生于真核细胞内的 G原核生物。是介于细菌与病毒之间，而接近于细菌的一类原核生物。一般呈球状或杆状,是专性细胞内寄生物，主要寄生于节肢动物，有的会通过蚤、虱、蜱、螨传入人体、如斑疹伤寒、战壕热。本产品就是以探针法荧光定量 PCR 技术为基础开发的专门检测立克次氏体的试剂盒，它具有下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。

2. 引物和探针经过优化，灵敏性高。

3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4. 特异性高，引物是根据立克次氏体通用高度保守区设计。

5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。

6. 本产品只能用于科研。

【试剂组成】

【储存条件及有效期】

低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。

【自备试剂】样品 DNA。

【使用方法】

一、稀释PCR 阳性对照（以10E1-10E6 拷贝/μL 这6个10倍稀释度为例）

如果做定性实验，则此步可以跳过。如果做定量实验，则需要稀释阳性对照做标准曲线。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分。本产品只提供 DNA 片段作为阳性对照。

1.  标记 6 个离心管，分别为 6，5，4，3，2，1。

2.         用带芯枪头分别加入 45μL 荧光 PCR 专用模板稀释液（最好用带芯枪头，下同）。

3.         在 6 号管中加入 5μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照（试剂盒提供），充分震荡 1 分钟， 得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

4.         换枪头，在 5 号管中加入 5μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5.         换枪头，在 4 号管中加入 5μL 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照（上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E4 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

6.         重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上用。

二、样品 DNA 的制备

7.         如果有 N 个样品，必须设置 N+2 个提取，多出的一个是样品制备 PC（样品制备阳性对照），一个是样品制备 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 阳性对照的 10000 倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为样品制备 PC。另外用水作为样品制备 NC。

8.         用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数 DNA/提取试剂盒兼容。

二、Probe qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）

9.         如果做定量分析并且只做1次重复，则标记 N+9个PCR 管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记 N+4 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于 PCR 阳性对照（用第4号管中的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为描述操作步骤，

在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设 置阳性对照，并且阳性对照样

10.         品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：

四、数据处理

12.         如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。

     13.    如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 35。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则为阴性，如果小于 40，则为阳性。