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马流行性感冒病毒RT-PCR检测试剂盒

简要描述:马流行性感冒病毒RT-PCR检测试剂盒马流感是马、驴和骡的一种急性呼吸道疫病,由正黏病毒科 A 型流感病毒属中的两个 A 型流感病毒亚型引起,分别为H7N7(曾称为马-1 型)和 H3N8(曾称为马-2 型)。

  • 更新时间:2024-04-17
  • 厂商性质:生产厂家
  • 生产地址:上海
  • 访  问  量:80

详细介绍

品牌YLKBIO货号YLK10391P
规格50T供货周期现货
主要用途科研实验应用领域化工,生物产业
保存条件低温运输,-20℃保存有效期12个月
试剂盒说明不同批号的试剂盒组分不可交互使用

马流行性感冒病毒RT-PCR检测试剂盒


产品名称:马流行性感冒病毒RT-PCR检测试剂盒

英文名称:Method of the real-time RT-PCR for the detection of Equine Influenza Virus (50 reactions)

马流感是马、驴和骡的一种急性呼吸道疫病,由正黏病毒科 A 型流感病毒属中的两个 A 型流感病毒亚型引起,分别为H7N7(曾称为马-1 型)和 H3N8(曾称为马-2 型)。禽liu感病毒被认为是两种亚型马流感病毒的祖先,易感马科动物的临诊症状表现为发热、刺耳地干咳和鼻流黏性脓性分泌物。

本试剂盒是依据OIE3.5.7 章马流感诊断国际标准中马流感国际参考实验室推荐的针对M 基因可以同时监测H7N7 和H3N8 等马流感病毒亚型的引物和探针序列,优化反应参数配套生产,探针的 5` 端和 3`端分别标记不同的荧光素,如 5`端标记 FAM 荧光素,3`端是 TAMRA 修饰。


【试剂组成】

试剂盒组成成分

体积

核酸扩增试剂:

DEPC 水

马流感荧光 RT-PCR 反应液酶混合物

阴性对照

马流感荧光阳性对照

 

1ml×1

750µL×1

55µL×1

1ml×1

1ml×1

3、 样本采集,存放及运输

 

3.1  样本采集:所用取样器材必须经高压灭菌并烘干。

用于检测多种样本(如肌肉、脏器、鼻或咽喉拭子、血清或血浆、组织渗出液等)中马流感病毒的 RNA。

3.2 存放:样品应尽快研磨提取核酸进行检测,-70 ℃以下可长期保存,但应避免反复冻融。

3.3  运输:采用冰壶或泡沫箱加冰密封进行运输。

4、 荧光 RT-PCR 检测


4.1 操作方法

4.1.1 样本的处理(在样本制备进行):

4.1.1.1  取 n 个灭菌的 1.5 mL Eppendorf 管,其中 n 为被检样品、阳性对照与阴性对照的和(阳性对照、阴性对照在试剂盒中已标出),做标记。(注:试剂盒中的阳性对照吹打混匀后直接作为PCR 检测的模板,无需提取核酸)

4.1.1.2  每管加入 600 mL 裂解液,分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各 200 mL,一份样本换用一个吸头,再加入 200 mL 氯仿,混匀器上振荡混匀 5 s(不能过于强烈,以免产生乳化层, 也可以用手颠倒混匀),于 4℃ 12 000 r/min 离心 15 min。

4.1.1.3  取与 4.1.1.1 相同数量灭菌的 1.5 mL Eppendorf 管,加入 500 mL 异丙醇(-20℃预冷), 做标记。吸取 4.1.1.2 各管中的上清液转移至相应的管中,上清液应至少吸取 500mL,不能吸出中间层,颠倒混匀。

4.1.1.4  于 4 ℃、12 000 r/min 离心 15 min(Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置),小心倒去上清,倒置于吸水纸上,沾干液体(不同样品须在吸水纸不同地方沾干);加入 600 mL 75% 乙醇,颠倒洗涤。

4.1.1.5  于 4 ℃、12 000 r/min 离心 10 min(Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置),小心倒去上清,倒置于吸水纸上,尽量沾干液体(不同样品须在吸水纸不同地方沾干)。

4.1.1.6   4 000 r/min 离心 10s(Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置),将管壁上的残余液体甩到管底部,小心倒去上清,用微量加样器将其吸干,一份样本换用一个吸头,吸头不要碰到有沉淀一面,室温干燥 3 min,不能过于干燥,以免 RNA 不溶。

4.1.1.7   加入 33 mL DEPC 水,轻轻混匀,溶解管壁上的 RNA,2 000 r/min 离心 5 s,冰上保存备用。提取的 RNA 须在 2 h 内进行 PCR 扩增;若需长期保存须放置-70 ℃冰箱内。

【推荐使用《《病毒基因组 DNA/RNA 离心柱型提取试剂盒》》,更方便快捷高效提取核酸】。注:提取的 RNA 须在 2 h 内进行 PCR 扩增;若需长期保存须放置-70 ℃冰箱内。

4.1.2          检测

4.1.2.1 扩增试剂准备(在反应混合物配制区进行):

从试剂盒中取出相应的荧光 RT-PCR 反应液、酶混合物,在室温下融化后,2000 r/min 离心 5 s。设所需荧光 RT-PCR 检测总数为 n,其中 n 为被检样品、阳性对照与阴性对照的和,每个样品测试反应体系配制见表 2:

表 2 每个样品测试反应体系配制表

试剂

RT-PCR   反应液

酶混合物

用量

15   μL

1.0 μL

根据测试样品的数量计算好各试剂的使用量,加入到适当体积试管中,充分混合均匀,向每个荧光RT-PCR管中各分装15mL,转移至样本处理区。

4.1.2.2  加样(样本处理区进行):

在各设定的荧光RT-PCR管中分别加入上述样本处理步骤4.1.1.7中制备的RNA溶液各10 mL,盖紧管盖,500 r/min离心30 s。(阳性对照不需要提取核酸,可以直接吹打混匀后吸取当模板)

4.1.2.3  荧光 RT-PCR 检测(在检测区进行):

将4.1.2.2中离心后的PCR管放入荧光RT-PCR检测仪内,记录样本摆放顺序。循环条件设置:

第一阶段,反转录 42℃/30 min; 第二阶段,预变性 94℃/2 min;

第三阶段,94℃ /15sec,55℃/10 sec, 60℃/30 sec 共 40 个循环.。荧光收集在第三阶段每

次循环的 60℃延伸时进行。

试验检测结束后,根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。

4.2  结果判定

4.2.1  结果分析条件的设定 阈值设定原则:根据仪器噪声情况进行调整,以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点为准。对于多通道荧光 PCR 仪,选定 FAM(465-510)检测通道读取检测结果, ABI 仪器选择 5’FAM; 3’TAMRA 淬灭基团。

4.2.2 质控标准

a)  阴性对照无 Ct 值并且无扩增曲线。

b)  阳性对照的 Ct 值应小于等于 30,并出现典型的扩增曲线。

c)  如阴性和阳性对照不满足以上条件,此次实验视为无效。

4.2.3 结果判定

a)  阴性:无 Ct 值,且无特征性扩增曲线,表明样品为阴性。

b)  阳性:Ct 值≤40.0,且出现典型的扩增曲线,表示样品为阳性,含有马流感病毒核酸。

【注意事项】

1.  实验室应至少分三个区:样品处理区、反应混合物配制区和检测区。

2.  各区物品均为专用,不得交叉使用,避免污染。检测结束后,应立即对工作台进行清洁。

3.  分装反应液时,应尽量避免产生气泡。上机前注意检查各反应管是否盖紧,以免荧光物质泄露污染仪器。

4.  阳性对照在吸取前应在微量漩涡振荡器上剧烈振荡 1~2 秒。

5.  试剂盒中各组分应避免反复冻融。

【规格】  50 份/盒

 【贮藏与有效期】荧光 RT-PCR 检测试剂盒-20℃保存,有效期为 12 个月;《病毒基因组 DNA/RNA 离心柱型提取试剂盒》室温保存。

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