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手足口EV71/CA16/EV三通道核酸检测试剂盒

简要描述:手足口EV71/CA16/EV三通道核酸检测试剂盒手足口病 ( hand, foot and mouth disease,HFMD)在近年儿童中常见流行 ,由肠道病毒感染引起 ,主要表现口腔黏膜溃疡性疱疹及四肢末端水疱样皮疹 ,主要病原为柯萨奇病毒 A16 型(CA16)和肠道病毒 71 型(EV71),二者所致的手足口病临床难以区别。

  • 更新时间:2024-04-18
  • 厂商性质:生产厂家
  • 生产地址:上海
  • 访  问  量:111

详细介绍

品牌YLKBIO货号YLK10403P
规格50T供货周期现货
主要用途科研实验应用领域化工,生物产业
保存条件低温运输,-20℃保存有效期9个月
试剂盒说明不同批号的试剂盒组分不可交互使用

手足口EV71/CA16/EV三通道核酸检测试剂盒


产品名称:手足口EV71/CA16/EV三通道核酸检测试剂盒

英文名称:Detection Kit for Enterovirus 71/Coxsackievirus A16/Enterovirus RNA (PCR-Fluorescence Probing)

手足口病 ( hand, foot and mouth disease,HFMD)在近年儿童中常见流行 ,由肠道病毒感染引起 ,主要表现口腔黏膜溃疡性疱疹及四肢末端水疱样皮疹 ,主要病原为柯萨奇病毒 A16 型(CA16)和肠道病毒 71 型(EV71),二者所致的手足口病临床难以区别。其中,EV71 不仅引起手足口病 ,而且可引起严重中枢神经系统并发症 ,如脑膜炎、脑炎、急性迟缓性瘫痪等。实现对肠道病毒的快速检测有利于疫情监测以及制定有效的预防控制措施。本试剂盒适用于粪便、咽/拭子、肛拭子样本中肠道病毒的检测,并可区分是否为肠道病毒 71 型或柯萨奇病毒A16 型。检测结果仅供研究,不用于临床诊断。

【试剂组成】

组分名称

规格

数量

主要成分

PCR 检测试剂

(50 反应/盒)

EV71/CA16/EV   PCR 反应液A

816µl/管

1

特异性引物、探针、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液等

EV71/CA16/EV PCR 反应液B

144µl/管

1

热启动Taq 酶、c-MMLV 酶等

质控品

阴性质控品

400µl/管

1

生理盐水

EV71/CA16/EV 阳性质控品

400µl/管

1

含目的片段的重组质粒

【运输及保存】

试剂盒保存于-20±5℃,有效期 9 个月。

试剂盒在 37℃可保存72 h;试剂在 4℃可保存7 天;避免反复冻融,反复冻融次数不超过 7 次;试剂开瓶次数不超过 7 次。运输采用干冰保持低温,运输时间不应超过 3 天。试剂盒生产日期见产品标签。

【适用仪器】ABI 7500、LightCycler480 等多通道荧光定量PCR 仪。


【注意事项】

1.样本处理和核酸提取(样本处理区)

建议取 200μl 液态样本进行核酸提取。可采用本公司生产的核酸提取/试剂盒,请按照试剂盒说明书进行操作;也可选择其他合适的商业化产品。

本试剂盒中的阴性质控品参与提取,用于对环境进行监控;EV71/CA16/EV 阳性质控品不参与提取,用于PCR 检测试剂的质控。2.PCR 试剂准备(试剂准备区)

从试剂盒中取出EV71/CA16/EV PCR 反应液A、EV71/CA16/EV PCR 反应液B,室温融化后振荡混匀,8,000rpm 离心数秒后使用。

2.1 EV71/CA16/EV 反应体系配制

取适量PCR 反应管,每管加入EV71/CA16/EV PCR 反应液A 17µl、EV71/CA16/EV PCR 反应液B 3µl(也可根据PCR 反应用量,计算各组分所需总量,混匀后分装 20µl 于单个PCR 反应管中);

3. 加样(样本制备区)

于上述PCR 反应管中分别加入处理后的阴性质控品、待测标本核酸、EV71/CA16/EV 阳性质控品各5µl,盖紧管盖,8,000rpm 离心数秒后转移至扩增检测区。

3.1  ABI Prism 7500 仪器设置(ABI 7500 仪器操作为例,ABI 7300 仪器参照此操作及仪器操作手册)

3.1.1 打开“Setup"窗口,按样本对应顺序设置阴性质控(NTC)、阳性质控以及未知样本(Unknown),并在“Sample Name"一栏中设置样本名称;探针检测模式设置为:Reporter Dye1:FAM,Quencher Dye1:none;Reporter Dye2:VIC ,Quencher Dye2:none; Reporter

Dye3:Texas Red,Quencher Dye3:none;Passive Reference:NONE.

3.1.1  打开instrument 窗口,设置循环条件如下: 50℃ 15 分钟,1 个循环;

95℃ 15 分钟,1 个循环;

94℃ 15 秒→55℃ 45 秒(收集荧光),40 个循环。设置完成后,保存文件,运行程序。

3.2  LightCycler480 仪器设置

3.2.1  点击软件主界面的“New Experiment",进入程序设定界面。

3.2.2  检测模式设置:从Detection Format 的下拉框中选择分析模式:Multi Color Hydrolysis Probe,“Customizes"模块中选择483-533、 523-568、 558-610 滤片组合,“Block Type"为仪器自动检测, “Plate ID"可手工输入或扫描仪扫描,“Reaction Volume"设定为 25ul。

3.2.3  循环参数:定义PCR 程序中每个步骤(Program Name)及循环数(Cycles)和分析模式(Analysis Mode),利用“+"和“-"增加或删除步骤,扩增参数如下:

50℃ 15 分钟,1 个循环;

95℃ 15 分钟,1 个循环;

94℃ 15 秒 55℃ 45 秒,40 个循环;(此步采集荧光信号:“Analysis Mode"选择“Quantification",“Acquisition Mode"选择 “Single")

40℃ 10 秒,1 个循环;

3.2.4  填样品表:点击“Sample Editor"模块,进入样本信息编辑界面,在“Select Workflow"中选择“Abs Quant",在“Sample Name" 列中定义样本名称,在“Sample Type"栏中选定样品类型:阴性质控品选NTC;未知样品选Unknown。

3.2.5  运行程序:点击“Experiment"模块,回到程序设定界面,点击窗口右下方的“Start Run",弹出结果保存窗口,输入文件名和路径后进入程序运行界面。

4.  结果分析

4.1  反应结束后保存检测数据文件。

4.2  分析条件设置:根据分析后图像调节Baseline 的start 值、stop 值以及Threshold 的Value 值(用户可根据实际情况自行调整, Start 值可以在 3~15、End 值可设在 5~20,调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线),点击 Analysis 自动获得分析结果,在 Report界面察看结果。

【质量控制】

阴性质控品:FAM、VIC、Texas Red 检测通路无明显扩增曲线;

阳性质控品:FAM、VIC、Texas Red 检测通路均有明显扩增曲线,且 Ct 值≤32; 以上要求需在同一次实验中同时满足,否则,本次实验无效,需重新进行。

【结果判断】

1.  若检测样品的扩增曲线在FAM、VIC、Texas Red 检测通路均无扩增曲线或Ct 值>38,可判样品为EV71、CA16、肠道病毒阴性;

2.  若检测样品的扩增曲线在FAM 检测通道有扩增曲线且Ct 值≤38,可判样品为EV71 阳性;

3.  若检测样品的扩增曲线在VIC 检测通道有扩增曲线且Ct 值≤38,可判样品为CA16 阳性;

4.  若检测样品的扩增曲线在Texas Red 检测通道有扩增曲线且Ct 值≤38,可判样品为肠道病毒阳性,此时FAM 或VIC 通道可能为阳性,说明样本为EV71 或CA16 阳性;FAM 及VIC 通道也可能均为阴性,说明样本为非EV71 非CA16 的其他型别肠道病毒。

【检测方法的局限性】

样本检测结果和样本收集、处理、运送及保存质量有关,其中任何失误都将会导致假阴性结果。如果样本处理时没有控制好交叉污染,可能出现假阳性结果。

【产品性能指标】

根据产品分析性能评估结果,本试剂盒的分析灵敏度为 1.0×103copies/ml。与感染部位相同或感染症状相似的其他病原体(乙型脑炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、单纯疱疹病毒、水痘病毒、腺病毒等)无交叉反应。

【注意事项】

1. 本产品仅用于体外诊断;

2. 实验室管理应严格按照PCR 基因扩增实验室的管理规范,实验人员必须进行专业培训,实验过程严格分区进行(试剂准备区、标本制备区、扩增和产物分析区),所用消耗品应灭菌后一次性使用,实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备,各区各阶段用品不能交叉使用;

3. 为试剂和标本准备阶段提供生物安全柜,实验过程中穿工作服,带一次性手套,使用自卸管移液器;

4. 试剂使用前要wan全解冻,8,000rpm 离心数秒后使用;

5. 标本制备区所用过的吸头请打入盛有消毒剂的容器,并与废弃物一起灭菌后方可丢弃;

6. 实验完毕用 10%次氯酸或 75%酒精处理工作台和移液器,然后用紫外线灯照射 20-30 分钟;

7. 本试剂盒内阳性质控品应视为具有传染性物质,操作和处理均需符合相关法规要求:卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》。

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