鼠疫耶尔森菌探针法荧光定量PCR试剂盒

鼠疫耶尔森菌探针法荧光定量PCR试剂盒

产品名称：鼠疫耶尔森菌探针法荧光定量PCR试剂盒

英文名称：YersiniapestisProbe qPCR Kit

鼠疫耶尔森菌也叫做鼠疫杆菌（Yersiniapestis）是鼠疫的病原菌，鼠疫是一种人兽共患的自然疫源性烈性传染病，人类鼠疫多为疫鼠的跳蚤叮咬而感染，  是我国法定的甲类传染病。此菌引起的是啮齿动物中的自然疫源性疾病，传染性强，病死率高，易酿成大流行，此菌主要累及皮肤和淋巴结，其次为败血症、肺炎、脑膜炎，对人体健康有较大危害，因此快速检测鼠疫耶尔森菌(鼠疫杆菌)具  有重要意义。本产品就是以探针法荧光定量 PCR 技术为基础开发的专门检测鼠疫耶尔森菌(鼠疫杆菌)的试剂盒，它具有下列特点：

1.       即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。

2.       引物和探针经过优化，灵敏性高。

3.       提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4.       特异性高，引物是根据鼠疫耶尔森菌(鼠疫杆菌)高度保守区设计，不会跟其 他病原 DNA 发生交叉反应。

5.       本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。

6.       本产品只能用于科研。

【试剂组成】

【自备试剂】样品 DNA。

【注意事项】

一、稀释标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原， 本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。

1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

2.       用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。

3.       在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震

荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

4.       换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5.       换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

6.       重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 DNA 的制备

7.       如果有 N 个样品，最好设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性

对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 阳性对照的 10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为 NC。

8.       用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数 DNA/提取试剂盒兼容。

三、Probe qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）

9.       如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），6 个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用第 4 号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10.       在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设  置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好

后最后加）：

11.     盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR：

四、数据处理

12.     如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品RNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。

13.     如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。若重复结果 Ct 值

小于 40，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。